可可毛色二孢全基因组分泌蛋白的预测及分析

【目的】可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback),影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并明确其基本特征,为该病菌分泌蛋白致病机理的研究打下基础。【方法】依据已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用信号肽预测软件SignalP v5.0、跨膜结构分析软件TMHMM v2.0、细胞器定位分析软件ProtComp v9.0、GPI锚定预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器定位分析软件TargetP v2.0生物信息学软件对该菌中的典型分泌蛋白进行筛选。对分泌蛋白N端信号肽的长度、氨基酸使用频率及其切割位点进行统计分析。依据蛋白序列的同源性,应用BLASTP程序对分泌组蛋白进行功能注释分析,预测其生物学功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统,对所选分泌蛋白的信号肽进行活性检测。利用qRT-PCR方法检测所选分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表达情况。【结果】在可可毛色二孢全基因组编码蛋白中共筛...     

可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1信号肽的鉴定及其酶活性分析

为明确可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1是否能够分泌至胞外及其活性,采用酵母互补试验分析了内切酶LtEg1的信号肽活性,利用3,5-二硝基水杨酸法检测了内切酶LtEg1活性,通过实时荧光定量PCR测定了LtEg1基因在不同侵染阶段的表达量。内切酶LtEg1的信号肽和酵母蔗糖酶的融合表达能够引起酵母蔗糖酶的外泌,使得酵母转化子能够在以棉子糖为唯一碳源的培养基上生长。内切酶LtEg1能够以羧甲基纤维素钠为底物,发挥其酶活功能。与营养菌丝阶段相比,LtEg1基因在病原菌侵染阶段的表达水平显著升高;且在接种后48 h,LtEg1基因的表达量达到高峰,约为营养菌丝阶段的12倍,表明内切酶LtEg1作为重要的外泌蛋白酶,在可可毛色二孢侵染致病过程发挥了重要作用。     

葡萄 VvSUC 27基因的克隆及病原响应表达分析

由葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback)是葡萄上的主要枝干病害之一, 严重影响葡萄产业的健康发展?其中, 致病力最强的为可可毛色二孢 Lasiodiplodia theobromae ?糖转运蛋白在调节植物对病原菌的免疫过程中起着至关重要的作用, 关于葡萄中糖转运蛋白参与植物免疫机制的研究尚未见报道?本试验从‘无核白’葡萄叶片中克隆得到蔗糖转运蛋白 VvSUC 27基因, 其开放阅读框全长1 515 bp, 预测蛋白质分子量为54 kD, 理论等电点(pI)为9.58?生物信息学预测该蛋白含有12个跨膜结构?实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明:氨基环丙烷羧酸和脱落酸处理后 VvSUC 27的表达水平持续上调; 水杨酸和茉莉酸甲酯处理后, VvSUC 27的表达呈现上调表现但无规律的变化特征; 激发子chitin和flg22处理后, VvSUC 27基因信号响应快速且明显; 感病品种‘夏黑’接种可可毛色二孢后, VvSUC 27被迅速诱导, 3 h时表达量达到最高, 而后逐渐减弱?本研究将为今后阐明可可毛色二孢与葡萄互作的分子机制提供参考依据?     

我国葡萄白粉病菌对吡唑醚菌酯的敏感性分析

【目的】建立我国葡萄白粉病菌对QoI类杀菌剂吡唑醚菌酯的敏感基线,明确葡萄白粉病菌对吡唑醚菌酯的抗性水平。【方法】采用孢子萌发法测定了吡唑醚菌酯对来自我国北京、湖南、宁夏、云南、江苏5个葡萄种植地区的145株葡萄白粉病菌的EC₅₀值,并利用荧光定量PCR法检测cytb基因上G143A的突变情况。【结果】吡唑醚菌酯对43株当年未施用过化学杀菌剂的葡萄白粉病菌菌株EC₅₀值呈连续性单峰且符合正态分布,其均值(1.387±0.107)μg·mL^-1作为葡萄白粉病菌对吡唑醚菌酯的敏感基线。采用孢子萌发法分析的结果表明,供试菌株对吡唑醚菌酯的抗性频率为45.52%,采用荧光定量PCR(G143A)法分析的结果显示供试菌株对QoI类杀菌剂的抗性频率为57.69%。在RF>2时,采用荧光定量PCR检测结果与孢子萌发法测定结果趋势一致,Pearson相关性分析结果显示二者存在显著相关性。【结论】我国葡萄白粉病菌对吡唑醚菌酯的抗药性发生较为普遍,应注意与不同作用机制的药剂轮换使用或混用,以延缓抗药性发展。