番茄不孕病毒BJ株系基因组测定与侵染性克隆

番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)可侵染包括藜科(Chenopodiaceae)、茄科(Solanaceae)等在内的24个双子叶家族和3个单子叶家族的100多种植物,是具有重要经济价值的植物病毒之一.为研究TAV BJ株系(Tomato aspermy virus,TAV-BJ)的基因组功能,本实验对TAV-BJ基因组克隆测序,并构建侵染性克隆.以TAV-BJ侵染心叶烟(ic otiana glutinosa)的总RNA为模板,RT-PCR获得其RNA2和RNA3;以TAV-BJ的dsRNA为模板,RT-PCR获得全长RNA1,目的片段PCR产物克隆测序获得TAV-BJ基因组全序列信息.RNA1全长3 409 nt,编码994个氨基酸的1a蛋白;RNA2全长3 023 nt,含2个开放阅读框(open reading frame,ORF),2a ORF编码829个氨基酸的2a蛋白,2b ORF编码78个氨基酸的2b蛋白;RNA3全长为2 216 nt,包含2个ORF,3a ORF编码247个氨基酸的3a蛋白,外壳蛋白(coat protein,CP)ORF 编码219个氨基酸的CP蛋白(TAV-BJ基因组RNA1、2和3 GenBank登录号分别为HQ424163,HQ424164和HQ424165).TAV-BJ基因组cDNA克隆体外转录成RNA并接种于心叶烟上,结果表明转录产物在寄主上的症状反应和TAV-BJ病毒粒子RNA的接种相一致,TAV-BJ基因组cDNA侵染性克隆具有活性.由TAV-BJ各个基因片段与缺失2b基因的黄瓜花叶病毒Fny株系(Cucumber mosaic virus,CMV-Fny△2b)构建的假重组病毒接种于心叶烟,结果显示TAV-BJ的RNA2和RNA3能恢复CMV-Fny△2b在寄主上症状反应.嵌合型RNA3F3aTcp和RNA3T3aFcp的症状反应结果表明,F1F2△2bRNA3 T3aFcp在寄主上产生花叶症状与F1 F2△2bT3相一致.本研究获得TAV-BJ的基因组序列,成功构建侵染性克隆,同时发现TAV-BJ的3a基因具有CMV-Fny的2b基因的某些功能.     

ToMV番茄坏死株系农杆菌侵染性克隆构建及其表达

番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的典型成员,该病毒侵染严重影响农作物的产量和质量。ToMV-N5株系能引起番茄(Lycopersicon esculentum)主栽品种(合作903)系统性坏死,建立该株系的侵染性克隆体系是研究其致病机理的必要条件。本研究将ToMV-N5株系的基因组克隆至含35S启动子瞬时表达载体pCB301中,农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)浸润接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)和番茄结果表明,农杆菌侵染性克隆pCB301-ToMV-N5引起本氏烟和番茄系统性坏死症状,与其病毒粒子摩擦接种所引起的症状相一致。以绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)代替ToMV-N5的外壳蛋白基因(coat protein,CP)获得表达载体pCB301-ToMV-N5CP45GFP,病毒接种结果表明,ToMV-N5能高效表达GFP,在病毒浸润接种浓度(OD600)为0.002时,GFP也能够有效表达。pCB301-ToMV-N5CP45GFP缺失了CP基因使得病毒不能系统性侵染,将烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)U5株系包含CP大小为647 nt(nt 5 498~6 145)片段克隆到pCB301-ToMV-N5CP45GFP中,获得pCB301-ToMV-N5CP45GFP-CPU5,浸润接种本氏烟结果表明,病毒能长距离移动,在寄主非接种部位表达GFP;浸润及摩擦接种番茄结果表明,只能在显微镜下观察到微弱GFP,且局限于接种部位。本研究成功获得了ToMV-N5株系的农杆菌侵染性克隆及其表达载体,为研究该病毒侵染的分子机理提供了基础资料。     

矮化突变番茄Micro Tom的快繁研究

对生命周期比一般番茄短的矮化突变体Micro Tom进行快繁研究。结果表明,子叶为愈伤组织、不定芽诱导的适宜外植体,MS＋IAA 0.2 mg·L^-1＋6-BA 3 mg·L^-1为适宜分化培养基,MS＋IBA 0.1 mg·L^-1＋NAA 0.1 mg·L^-1为适宜生根培养基,组培苗经过炼苗成活率可达95%。     

稻瘟病菌几丁质结合蛋白MoChtbp1的功能初步研究

稻瘟病是一种由子囊真菌稻瘟病菌引起的危害粮食安全的世界性病害.多数效应蛋白对于稻瘟病菌的毒力起到重要作用,在与寄主植物的相互作用中至关重要,因此,筛选并鉴定稻瘟病菌效应蛋白,阐释其基因功能对于稻瘟病的防治具有重要意义.本研究根据已有的稻瘟病菌效应蛋白相关研究方法以及生物信息学软件筛选出了一个几丁质结合蛋白Mo-Chtb...     

转基因番茄研究进展

概述基因荛在番茄抗病毒、抗病虫害、抗除草剂、提高耐贮藏性、抗寒性、改善风味品质和育性等遗传改良的应用。展示利用基因工程进行番茄品种改良的广阔前景。     

侵染上海番茄的黄瓜花叶病毒及其卫星RNA的32P分子标记杂交检测及分子鉴定

2004和2005年夏季,在上海郊区露天栽培的番茄地出现典型的病毒病危害,并造成严重的产量损失。分别以32P标记的CMV基因组RNA3部分序列和卫星RNA的cDNA探针对自然感病的番茄叶组织和提纯的病毒粒子中提取的总RNA进行杂交检测,确定以上植物组织和病毒粒子中均具有CMV及卫星RNA。dsRNA分析确定自然感病叶组织中具有典型黄瓜花叶病毒(CMV)基因及其卫星RNA条带。以常规引物对感病植物的总RNA进行RT-PCR扩增,获得CMV RNA3全长克隆,经测序显示该RNA3序列属于CMV亚组Ⅱ;通过在卫星dsRNA两端分别加上15nt的单链DNA接头,以接头互补序列为引物进行扩增获得一个383nt的卫星RNA的全长序列。同源性分析结果显示其与已报道的CMV卫星RNA同源性为72.6%~99.5%,但其3′末端存在多个碱基的突变。根据同位素杂交检测及分子鉴定,CMV及其卫星RNA变异类型在上海自然感病番茄上发生和普遍存在,可能对病害流行和新的症状出现产生影响。     

植物防御素及其研究进展

植物防御素是一类小肽物质,具有很广的抑菌谱.本文对植物防御素生物学特性、产生机理、空间结构以及作用机理进行了综述,并简述了其研究意义和应用前景.     

一个植物半胱氨酸蛋白酶多克隆抗体的制备及其应用

半胱氨酸蛋白酶 (cysteine proteinase,CysP)是一类重要的蛋白酶家族,广泛参与植物多种生理过程。为了分析植物CysP的特性,本实验首先通过RT-PCR技术从本氏烟中扩增获得了一个编码CysP的基因(NbCysP)序列并连接至pEASYTM-T5 Zero载体,测序验证后亚克隆至原核表达载体pGEX-6P1,命名为pGEX-NbCysP;将其导入大肠埃希菌BL21plysS中诱导表达;重组表达的NbCysP融合蛋白经过亲和层析纯化,免疫兔子制备多克隆抗体,Western印迹分析显示,该抗体能和重组NbCysP蛋白发生强烈的免疫学反应且条带单一,表明所获得的CysP抗体具有良好的特异性。上述结果为进一步鉴定植物CysP的功能特性奠定了基础。     

黄瓜花叶病毒辣椒分离物侵染性克隆构建

 【目的】鉴定引起辣椒产生褪绿黄化症状的病原物,构建侵染性克隆。【方法】大田辣椒样品通过ELISA检测,结合病毒外壳蛋白SDS-PAGE及病毒RNA分析,初步确定辣椒中病原物为黄瓜花叶病毒（CMV）Phy株系。以辣椒病毒粒子RNA为模板,采用含T7启动子的不同正向引物通过RT-PCR扩增CMV-Phy全长基因组RNA1、RNA2和RNA3。PCR产物经过双酶切后连接到pUC118载体,并分别比较5种（DH5α、HB101、JM109、LE392和NM522）感受态细胞的转化效率。体外转录CMV-Phy的基因组cDNA克隆（pUC-P1、pUC-P2和pUC-P3）成RNA分子（P1P2P3）,分析其转录效率和侵染活性。P1P2P3与CMV的卫星RNA进行假重组,进一步确定CMV-Phy侵染性克隆的成功构建。【结果】引起辣椒产生褪绿黄化症状病原物为CMV,携带卫星RNA;心叶烟接种辣椒病毒粒子后同样产生褪绿黄化症状。HB101感受态细胞最适合CMV-Phy基因组转化。CMV-Phy基因组及其卫星RNA的大小如下：RNA1为3 356 nt、RNA2为3 048 nt和RNA3为2 220 nt,卫星RNA Pz-satRNA为384 nt（序列登陆号分别为：DQ402477,DQ412731 ,DQ412732 EF363688）。CMV-Phy的cDNA克隆体外转录在5′端添加G有利于提高转录效率,但影响其侵染活性;P1P2P3在苋色藜和心叶烟产生的症状与其病毒粒子产生的症状相一致。除了Pz-satRNA,P1P2P3还能作为T1-satRNA、Rs-satRNA和Tsh-satRNA辅助病毒;T1-satRNA可加重CMV-Phy在心叶烟症状反应,而其它3个卫星RNA则对此起减弱作用。【结论】以病毒粒子RNA为模板,采用touch-up PCR扩增参数在1个反应管中同时获得CMV-Phy基因组RNA1、RNA2和RNA3;CMV-Phy RNA1、RNA2和RNA3的5′端添加1个G最有利于侵染性克隆构建。