猴D型逆转录病毒P27基因的表达、纯化及重组蛋白的鉴定

根据GenBank上已发表的猴D型逆转录病毒SRV-2株基因组序列设计合成了一对特异性引物,通过PCR扩增出P27基因。将扩增出的片段克隆到原核表达载体pBAD/Thio-TOPO上,通过序列分析证实该片段与猴D型逆转录病毒SRV-2株P27基因序列一致。将阳性重组质粒转化至大肠杆菌T0P010中,用阿拉伯糖诱导表达,表达的融合蛋白进行SDS-PAGE和WesternBlot分析,并用proBondTM柱在天然状态下进行纯化。结果表明,表达的融合蛋白分子量约为50KDa,其大小与预期相符。     

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

本研究以原核系统表达的非洲猪瘟病毒CD2v膜内区重组蛋白为免疫原接种BALB/c小鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和多次亚克隆获得了8株能够稳定分泌CD2v蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为RH1、RH3、RH4、RH5、RH6、RH8、RH9和RH10。8株单克隆抗体的轻链类型均为Kappa型,其中RH1、RH5、RH9这3株单克隆抗体的重链亚型为IgG2b,其余5株单克隆抗体的重链亚型为IgG1。Western blot和免疫荧光试验证明获得的单克隆抗体具有良好的反应性,能特异地识别昆虫杆状病毒表达系统重组表达的CD2v蛋白,可为非洲猪瘟病毒结构蛋白的功能解析以及血清学诊断方法的开发提供重要的生物学材料。     

小反刍兽疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99～104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。     

樟芝皿培菌丝提取物体外对SPCA-1肺癌细胞增殖的抑制作用

利用细胞克隆实验、划痕实验和alamarBlue^TM细胞活力测定实验评价樟芝皿培菌丝体醇提物石油醚萃取相和氯仿萃取相对SPCA-1非小细胞肺癌的体外抑制作用,并进一步利用流式细胞术Annexin V-FITC(fluorescein isothiocyanate)/PI(propidium iodide)双染测定细胞早期凋亡率、流式细胞术2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescindiacetate,H2DCFDA)单染测定ROS(reactive oxygen species)释放量、流式细胞术PI单染测定细胞周期变化和ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、p53和PARP的表达,探讨樟芝皿培菌丝体醇提物石油醚萃取相和氯仿萃取相抑制SPCA-1增殖的作用机理。研究结果表明:樟芝皿培菌丝体醇提物石油醚萃取相和氯仿萃取相均能抑制SPCA-1细胞克隆的形成、迁移和增殖,石油醚萃取相的活性明显好于氯仿萃取相;石油醚萃取相通过促进SPCA-1释放ROS来诱发线粒体依赖性早期凋亡的发生,并使促凋亡蛋白Caspase-3和p53表达上升,同时抑制蛋白PARP表达,从而发挥其抑制SPCA-1肺癌细胞增殖的作用;而氯仿萃取相主要通过将SPCA-1细胞阻滞在S期抑制其增殖。     

《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》演变历程解读

依据公布的《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》近4次修订情况,对《名录》的名称、分类、疫病分类、疫病种类、疫病数量及发布形式等方面的调整作了分析,并分别与其前一版本作比较。其中:1992年至2013年调整较大,为进一步适应新形势下动物疫病的防控需要,疫病种类数量从97种增至206种;在风险评估的基础上,2020年《名录》中的疫病种类由2013年的206种调整为211种,新增疫病14种,删除疫病9种,同时对部分疫病的分类和名称进行了修订。2020年《名录》与目前国内外动物疫情形势结合紧密,更具科学性、全面性、合理性,将为把好国门生物安全发挥关键作用。     

猪传染性胃肠炎病毒山东分离株SD-LY6的N蛋白基因序列分析及其表达纯化

为了获得能够用于猪传染性胃肠炎(TGE)鉴别诊断的抗原蛋白,本研究以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)山东分离株SD-LY6核衣壳蛋白(N)基因为研究对象,对其进行引物设计并进行RT-PCR扩增,经克隆测序后对N蛋白基因序列进行分析;同时对N蛋白基因进行克隆,构建重组质粒pET-15b-TGEV-N,并进行IPTG诱导表达及纯化,利用SDS-PAGE和Western-blot进行检测。研究表明,TGEV SD-LY6株N蛋白基因序列高度保守,核苷酸以及氨基酸序列同源性均在97. 0%以上;获得了大小约为47 ku的纯化重组N蛋白,该重组N蛋白可以与猪传染性胃肠炎阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性,与无关血清样本无交叉反应,可以作为TGE的诊断抗原,为下一步高效快速诊断方法的研究提供坚实的基础。     

小反刍兽疫病毒N基因在昆虫细胞中的表达

为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ和KpnⅠ特异性酶切位点,将N基因克隆于昆虫杆状病毒表...     

小反刍兽疫流行病学及防控研究进展

小反刍兽疫是山羊、绵羊以及一些野生小反刍动物的一种急性或亚急性接触性传染病,自从首次发生以来一直呈扩大趋势,成为了严重危害畜牧业生产安全的重大跨国动物疫病之一。诊断技术和疫苗接种是预防控制小反刍兽疫的重要手段,根据小反刍兽疫典型的临床症状可初步做出假设性诊断,但确诊需要实验室诊断技术的支持。论文从小反刍兽疫目前的世界分布情况、小反刍兽疫病毒的起源以及易感动物等方面阐述了该病的流行病学特征,介绍了小反刍兽疫病毒实验室诊断技术的研究进展及几种具有应用前景的小反刍兽疫疫苗,为该病的研究和有效防控提供依据。     

检测猪瘟病毒E0抗体ELISA方法的建立与应用

E0蛋白是猪瘟病毒(CSFV)重要的结构蛋白之一,能刺激机体产生中和性保护抗体,同时也是作为鉴别诊断的标识之一.本研究通过RT-PCR扩增得到石门株E0基因,构建了重组质粒pET-28a-E0,原核表达E0目的蛋白后鉴定了其免疫反应性.将纯化后的目的蛋白进行梯度稀释,建立了 ELISA检测方法,优化反应条件如下:最佳蛋...     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单抗制备及B细胞线性抗原表位鉴定

以原核系统表达的非洲猪瘟病毒p54重组蛋白为免疫原接种BALB/c小鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和多次亚克隆获得了3株能够稳定分泌抗p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为2A4、5F6和RH15。3株单克隆抗体的重链均属于IgG1亚类,轻链均为Kappa型。Western blot和免疫荧光试验(IFA)证明3株单克隆抗体具有良好的反应性,可以用于靶抗原的特异性检测。通过噬菌体展示肽库筛选,确定了单克隆抗体2A4、5F6识别的抗原表位为¹⁵⁷NTASQ¹⁶¹,RH15识别的抗原表位为¹⁷⁰RQRNTYTHKDL¹⁸⁰,进一步完善了靶抗原的B细胞线性抗原表位信息。