苹果分子标记及辅助育种研究进展

从基于集群分离分析法、杂交群体、全基因组关联分析和功能基因分子标记4个方面对苹果相关的分子标记及其在辅助育种上的应用进行了综述,为苹果分子标记辅助育种和揭示重要性状的遗传提供依据。     

苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因（PEPCKs）的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica Borkh.）多个代谢途径中的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）基因MdPCKs,研究其在不同组织器官及不同胁迫处理条件下的表达特性,为解析该基因在多个代谢途径中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和RT-PCR技术,克隆获得MdPCK1和MdPCK2全长cDNA序列并进行生物信息学分析;克隆MdPCKs的启动子序列,利用PlantCARE软件在线分析启动子上的顺式作用元件;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测MdPCKs在不同组织中的表达以及在水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、模拟干旱（PEG）、高温（40℃）和低温（8℃）处理条件下的表达特性。【结果】获得2个苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因（MdPCK1和MdPCK2;GenBank登录号分别为KT454964和KT454965）,其开放阅读框（open reading frame,ORF）分别为2 001 bp和2 028 bp,分别编码666和675个氨基酸残基;基因结构和进化分析表明,MdPCK1和MdPCK2均由12个外显子组成,且序列结构进化高度保守;氨基酸序列和结构分析显示,二者均含有保守的PEPCK ATP domain区域;启动子分析显示,MdPCK1和MdPCK2启动子区域含有多个顺式作用元件,包括光响应元件、昼夜节律相关顺式作用元件、JA响应元件、SA响应元件、ABA响应元件、防御及逆境响应元件、低温响应元件和热激响应元件等;qRT-PCR结果显示,MdPCKs在被检测的组织中均有表达。在‘泰山嘎啦’苹果果实不同发育阶段,MdPCK1和MdPCK2具有相似的表达模式。在多种非生物胁迫处理下,MdPCK1受到100 μmol·L^-1 ABA和100 g·L^-1 PEG胁迫诱导;MdPCK2受到150 μmol·L^-1 SA、100 μmol·L^-1 ABA、100 g·L^-1 PEG和低温胁迫诱导。【结论】MdPCK1和MdPCK2属于植物PEPCK家族,非生物逆境胁迫可诱导MdPCK1和MdPCK2表达。     

着色与非着色苹果品种中磷酸化蛋白质的鉴定与分析

【目的】苹果着色是一个重要的质量性状,构建苹果磷酸化蛋白质组并进行鉴定与分析,了解在苹果着色过程中的蛋白质磷酸化,为进一步阐明苹果着色机理提供参考。【方法】以着色‘嘎拉’和非着色‘金冠’两个品种苹果果皮为试材提取总蛋白,用TiO₂富集磷酸化肽段,对富集到的磷酸化肽段进行高效液相色谱分离,利用质谱鉴定磷酸化肽段,采用Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4（thermo）软件进行蛋白质查库鉴定,使用的数据库为Uniprot_Maloideae.fasta。对鉴定到的磷酸化肽段和蛋白质进行分析,找出着色与非着色苹果品种中有差异的磷酸化蛋白质及其修饰位点。【结果】在着色苹果品种中鉴定到1 323个蛋白质、3 339个肽段和225个磷酸化肽段,发现磷酸化蛋白质约200-225种;在非着色苹果品种中鉴定到569个蛋白质、1 152个肽段和128个磷酸化肽段,发现磷酸化蛋白质约117-128种。比较分析表明,43个磷酸化肽段仅在非着色苹果品种中发现,139个磷酸化肽段仅在着色苹果品种中发现,在着色苹果品种中有更多的蛋白质发生了磷酸化,其中质膜H⁺-ATPase在两个苏氨酸位点发生磷酸化,过敏原蛋白和两个蛋白激酶在丝氨酸位点发生磷酸化,3个转录因子、1个钾转运蛋白和1个受体激酶都发生磷酸化。在两个苹果品种鉴定出的蛋白质中,发生蛋白质磷酸化的位点主要是丝氨酸,其次是苏氨酸,在酪氨酸位点发生蛋白质磷酸化很少。蛋白质WD40和花青苷合成途径中的相关酶蛋白C4H、4CL、CHS、CHI、F3′H、FLS、LDOX和UFGT在着色过程中未发生磷酸化。在着色和非着色苹果品种中都存在MYBR转录因子,并且都发生了蛋白质磷酸化。【结论】在着色苹果品种中产生了一些特有的磷酸化蛋白质,其中包括已知与着色相关的质膜H⁺-ATPase,苹果着色可能受到蛋白质磷酸化的影响。     

山东主栽矮化中间砧苹果抗旱性主成分及隶属函数分析

使用抗旱性的砧木是解决目前苹果生产干旱问题的有效手段,但目前对于普遍使用的矮化中间砧并没有一个科学的抗旱性的评价。本研究利用主成分分析和隶属函数相结合的方法对山东普遍使用的矮化中间砧M26、SH40、MM106、M9和GM256（品种‘‘烟富3’’,基砧平邑甜茶）的抗旱性进行了综合评价。通过对干旱胁迫相关生理生化参数相对含水量(RWC)、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性糖、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、叶绿素(Chl)含量进行主成分分析,利用隶属函数和权重计算求得综合评价值进行分析评价。结果表明：矮化中间砧M26、SH40、MM106、M9、GM256的综合评价值分别为：0.757、0.716、0.457、0.263、0.136,由此确定山东地区普遍使用的矮化中间砧抗旱性强弱顺序为：M26 >SH40 >MM106>M9 >GM256。     

苹果矮化砧‘71-3-150’对冷胁迫的生理与转录组响应

为探索苹果矮化砧木抗寒的生理和分子机制,筛选抗寒相关基因,分析了苹果高抗寒矮化砧木‘71-3-150’在冷胁迫(4℃)0、2、6、12和24 h时的膜伤害、活性氧代谢、渗透调节物质积累等生理指标及转录组的变化。结果表明:‘71-3-150’在冷胁迫0~2 h即表现出抗氧化和渗透调节反应,6 h后SOD、CAT等活性氧清除酶活性及主要渗调物质维持在较高水平趋于稳定,膜伤害加重趋势缓解,说明其具有快速响应冷胁迫的生理机制,0~6 h是其冷适应的关键时期;转录组分析表明,0 h vs 2 h、0 h vs6 h、0 h vs 12 h和0 h vs 24 h等比较组分别含有491、1 115、828和1 047个上调差异表达基因及537、688、708和1 016个下调差异表达基因,其中4个组共有的115个上调基因和136个下调基因表现为6种表达模式;筛选出28个‘71-3-150’冷适应过程中存在显著差异表达的功能基因与转录因子基因,调控低温信号感知与传导的基因在0~2 h出现显著性上调表达,参与渗透调节、活性氧代谢、膜和蛋白保护等过程的基因随低温处理呈现多样性表达模式,表明该砧木在冷适应过程中存在快速和多样的低温信号感知、转导和响应的分子机制。     

花粉直感效应对“富士”苹果套袋果实挥发性成分的影响

以"烟富3"富士苹果为试材,研究比较了在2个试验地点,采用5个品种授粉的花粉直感效应对"富士"苹果套袋果实挥发性成分的影响,以期筛选适宜的授粉品种并为套袋"富士"风味品质提升技术提供参考。结果表明:5个授粉品种对"富士"套袋果实挥发性成分存在显著的花粉直感效应,在2个试验点的"富士"果实挥发性成分和特征香气成分数量均以"金冠"授粉较多,以"嘎拉"授粉较少,"新红星""锦绣海棠"和"红宝石"授粉在2个试验地间存在差异,主要由于有12种成分仅在部分样品中检测到,这些差异成分含量均较低,除2-甲基丁酸乙酯,其它成分对果实香味没有影响;"新红星""红宝石"对提高醇类含量有显著地促进作用,"金冠""新红星"和"嘎拉"对提高醛类含量有显著地促进作用,而"金冠""新红星"和"红宝石"对于酯类和萜烯类成分含量的提高作用更显著,"锦绣海棠"授粉时,果实4类挥发性成分含量均较低;授粉品种在不同地点对套袋"富士"果实挥发性成分的花粉直感效应相对稳定。     

辐照处理对苹果嫩枝变异效应研究

为探讨辐照处理对苹果嫩枝嫁接成活率及变异率的影响,以富士嫩枝为试材,采用60Co-γ射线以不同剂量进行辐照处理。结果表明,在20~60 Gy辐照剂量范围内,随着辐照剂量的增加,嫁接成活率呈下降趋势,枝条生长量减少,叶面积降低,二叉枝和多叉枝数量增加。半致死剂量LD50为30 Gy,此剂量下嫁接成活率为49.2%;利用AFLP分子标记对成活的枝条进行变异检测,变异率达1.17%,变异梢多分布在二叉枝和多叉枝上,基因位点上的突变与枝梢形态变异有一定的相关性。本研究结果为加快选育苹果优良新品种提供了新途径。     

不同种类砧木对苹果果实挥发性成分的影响

本试验采用60-160、BP、71-3-150、M26、M9T337和平邑甜茶共6种砧木嫁接沂水红富士苹果,比较其嫁接品种成熟果实的挥发性成分种类和含量。结果表明,采用60-160砧木嫁接对果实香气成分总数、特征香气成分数量有促进作用,其次为BP砧木,71-3-150与M26嫁接的果实特征香气成分较少;M9T337、60-160嫁接的果实酯类总量较高,醇类与醛类含量分别以71-3-150和60-160嫁接的较低,BP嫁接的果实萜烯类含量较高。综合分析表明,60-160砧木在促进果实香味提升中具有促进作用,是苹果优质生产的候选矮化砧木之一。