柞蚕凝集素ApIML基因的克隆与表达

在昆虫的免疫防御系统中,凝集素介导的免疫反应起着重要作用。本文克隆了柞蚕凝集素蛋白基因ApIML,序列分析表明：ApIML含有927bp的开放阅读框,编码309个氨基酸。柞蚕凝集素属于分泌型蛋白质,N端有21个氨基酸组成的信号肽,含有2个糖识别结构域。系统进化分析显示ApIML与二化螟Cs-1属于同一个分支,序列相似度为70.16%。构建了ET28a-ApIML原核表达载体,经SDS-PAGE检测发现蛋白在BL21(DE3)中成功表达,并且在Ca²⁺存在时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有凝集作用。     

重组柞蚕溶菌酶在柞蚕蛹中的分泌表达及纯化

利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统(AnpeNPV expression vector system)在柞蚕蛹体内分泌表达柞蚕溶菌酶(ApLz),并建立重组蛋白的分离纯化方法。选用柞蚕30 kD蛋白信号肽构建分泌型转移表达载体pApBacDual-N1/L21Ap30kDSP,将Aplz基因克隆至该载体中,重组DNA转化感受态细胞DH10B/AnpeBac^Δcc,通过抗生素抗性及蓝白斑筛选获得重组杆粒AnpeBac^Δcc/phAplz,并经PCR检测确认。重组杆粒DNA转染Tn-Hi5细胞后得到具有感染性的重组病毒Anpe-NPV^Δcc/phAplz。重组病毒感染柞蚕蛹6～7 d后收集柞蚕蛹血淋巴,利用His-tag Purification Resin和StrepTrap HP亲和层析柱对重组ApLz进行两步分离纯化。重组ApLz经SDS-PAGE和Western blot鉴定、蛋白质N端测序分析以及抗菌活性检测,结果显示,重组ApLz可以通过AnpeNPV表达载体系统在柞蚕蛹中得到分泌表达,经过两步层析分离得到的重组...     

大孔树脂分离纯化柞树叶总黄酮及其抗氧化活性研究

[目的]研究柞树叶总黄酮的纯化工艺及抗氧化活性.[方法]采用静态吸附与解析的方法,通过比较6种大孔树脂的吸附和解析性能,优选适宜的大孔树脂,并优化适合分离柞树叶总黄酮的解析条件.以VC为对照,对其还原力、DPPH自由基(DPPH·)和超氧阴离子自由基(O2-·)的清除能力进行研究.[结果]D101型大孔树脂纯化柞树叶总黄酮吸附与洗脱效果最好,其纯化最佳工艺条件为粗提液浓度0.55 mg/mL、上样流速1.5 mL/min、洗脱剂40％乙醇(V/V)、洗脱流速1.5 mL/min,柞树叶总黄酮纯度可达65.5％;分离纯化后柞树叶总黄酮具有良好的总还原能力以及清除DPPH自由基和抗超氧阴离子自由基活性,其总还原力大于VC的还原力,当质量浓度为0.03 mg/mL时,对DPPH自由基和抗超氧阴离子自由基的清除率分别为85.9％和65.9％.[结论]D101大孔树脂可用于柞树叶总黄酮的分离纯化,柞树叶总黄酮具有较强的抗氧化活性.     

利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。     

柞蚕血球细胞体外培养及对核型多角体病毒的感染研究

分别采用Grace、TC-100和MGM-448加20％胎牛血清和10％苯基硫尿做为细胞原代培养基,在27℃,pH6.2～6.4的条件下,对5龄柞蚕(Antheraea pernyi)幼虫血球细胞进行体外培养,发现细胞在培养1h后基本贴壁,在相差倒置显微镜下观察三种培养基细胞形态各异,原代培养的细胞主要是椭圆形、梭形和不规则形,进行了45d培养试验,观察结果表明:三种培养基中Grace培养基优于其他两种,其新生细胞增殖较快,细胞透明,大约10d左右即基本长满瓶底,15d进行第一次传代,传代培养细胞主要以园形和椭圆形为主.利用Grace培养基培养传代第2代的细胞进行柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)的感染实验,通过相差倒置显微镜和电子显微镜观察呈现出典型的细胞病理变化,感染7d细胞感染率可达75％.     

柞树叶总黄酮乙醇提取工艺及抑菌活性研究

[目的]对柞树叶中总黄酮的乙醇提取工艺进行了研究,同时考察柞树叶总黄酮提取物对几种常见食源性细菌的抑菌作用。[方法]以单因素试验为基础,通过正交试验来探讨料液比、提取温度、浸提时间和乙醇浓度对柞树叶中总黄酮提取效果的影响,确定最佳提取工艺条件,并采用抑菌圈法对痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌4种常见食源性细菌进行体外抑菌活性测定。[结果]柞树叶中总黄酮乙醇提取工艺为料液比1∶20(g∶mL),提取时间90 min,提取温度60℃,提取剂为50%的乙醇溶液,在该条件下,提取液中的总黄酮含量达5.06%。提取物在体外对4种食源性细菌的生长均有抑制作用,抑菌活性随着样品浓度的增大而增加。对4种供试菌的体外抑制作用由强到弱依次为痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌。[结论]柞树叶总黄酮乙醇提取工艺简单、可行,其提取物可用于天然食品防腐剂的开发。     

柞蚕NPV转移载体组建及外源基因在Sf9细胞、柞蚕卵巢原代细胞和蛹体中的表达

根据对载有ApNPV核多角体蛋白基因的片段的酶谱和核苷酸序列分析结果,采用人工合成寡核苷酸引物引导的点突变方法,去掉了该基因的起始密码子(ATG突变为ATT),经系列克隆组建了pApM740转移载体,其外源基因插入位点为nt+141(BamHI)。系用多聚酶链反应(Polymerase Chain Rea-ction简称PCR)技术,分别将nt+2～+140,nt+9～+140、和nt+37～+140切掉,组建了pApM740、741、748和736转移载体,其外源基因克隆位点分别为nt+1、+8和+36(均为BamHI切点)。将IL-4、DE基因分别克隆到pApM740、741、748和736载体中,并进行了转染表达实验:(1)将载有DE基因的上述四种载体质粒DNA分别与AcNPV_(WT)DNA共转染Sf9细胞、经免疫抗体荧光检测,供试4个载体所载DE基因均得到表达;(2)将pApM741-IL_4和pApM748-IL_4重组载体质粒DNA分别与ApNPV_(WT)DNA共转染柞蚕卵巢原代细胞,待多角体出现后,用PCR法检测病毒基因,证实IL-4基因已整合到ApNPV DNA基因组中;(3)将pApM748-DE重组载体质粒DNA与ApNPV _(WT)DNA共转染柞蚕蛹获得成功。对病蛹病毒DNA进行PCR检测,证实DE基因已整合到病毒基因组中;取病蛹体液,用免疫沉淀及Western blotting方法检测DE蛋白,证实DE蛋白确已被表达。从而初步建立了柞蚕NPV载体—昆虫细胞宿主和柞蚕NPV载体—柞蚕蛹活     

柞蚕精子形态的显微观察

对柞蚕蛹睾丸中的精细胞、柞蚕雄蛾睾丸中的精（子）细胞、柞蚕雄蛾贮精囊内精子（柬）、柞蚕雌蛾交配囊内精子（束）等进行了形态学及解剖学初步观察研究,为利用精子为载体进行动物转基因研究提供理论基础。     

农村向城市化转变中拆迁工作存在的问题与建议

结合现实拆迁工作,对拆迁中存在的主要问题进行了解析,并在基础上提出几点建议。