茶树N-甲基转移酶基因启动子克隆及功能分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能物质,N-甲基转移酶（NMT）是其生物合成的关键酶。本研究以英红9号茶树新梢为材料,利用hiTAIL-PCR克隆NMT1基因启动子,并采用Plant CARE等在线软件分析其顺式作用元件。根据其元件组成,设计5'递减的启动子与GUS基因一起组建了融合载体转入烟草,利用GUS染色和定量PCR方法,分析了克隆的启动子功能及其对环境因子的响应。结果表明,克隆的NMT1基因启动子长767βbp,含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子基本元件及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。以5'递减的NMT1启动子替换pBI121中的CaMV35S启动子,构建出与GUS融合的pA、pB、pC、pD载体。在烟草叶片中进行瞬时表达,不同长度的NMT1启动子均具驱动GUS表达功能,且长度越长驱动能力越强。以含全长NMT1启动子载体pA对烟草转基因,转基因烟草各组织均检测到GUS基因的表达且表达量叶>茎>根,叶片中的表达量为根部的3倍。对转基因烟草进行不同程度光照、温度、模拟干旱和脱落酸处理后,除40℃温度条件外,其他处理的叶片中GUS基因表达在处理前后均存在显著变化,表明NMT1启动子功能受外界环境因子的胁迫影响。     

RNAi沉默CsHB1降低茶树叶片愈伤组织咖啡碱积累

以‘英红9号’茶树叶片为材料,克隆HD-Zip转录因子基因CsHB1,原核表达CsHB1重组蛋白,利用本氏烟草进行CsHB1表达蛋白的亚细胞定位;构建CsHB1的RNAi转基因载体,经农杆菌介导转化‘英红9号’茶树叶片愈伤组织,并对沉默CsHB1愈伤组织系进行基因表达分析和咖啡碱含量测定。结果表明,克隆基因与NCBI登记的‘龙井43’茶树Cs HB1(MF033534)有6个碱基差异,但编码相同的氨基酸序列;原核诱导表达获得CsHB1的49 kD不可溶蛋白;将CsHB1蛋白亚细胞定位于细胞核和细胞质。在沉默表达CsHB1愈伤组织中,CsHB1表达显著下降,催化茶叶咖啡碱合成的N–甲基转移酶基因yhNMT1表达下调,愈伤组织中咖啡碱含量显著降低。推测转录因子基因CsHB1的沉默抑制了靶基因yhNMT1的表达,进而降低‘英红9号’愈伤组织中咖啡碱的合成积累。     

茶儿茶素合成关键酶基因CsANS和CsLAR的功能鉴定

以‘英红9号’茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]为材料,克隆了儿茶素合成途径的两个关键酶基因CsANS和CsLAR,并利用原核表达、亚细胞定位以及转基因表达分析对其功能进行鉴定。结果表明,CsANS和CsLAR开放阅读框（openreadingframe,ORF）分别长1068和1029bp,与TPIA数据库中来源于‘舒茶早’的对应基因同源性均高达99%。CsANS和CsLAR可溶性蛋白均能在原核表达系统诱导获得,并经GST标签成功纯化。本氏烟草叶片的瞬时表达结果显示,CsANS和CsLAR编码的蛋白定位于细胞质和细胞核。利用农杆菌介导的遗传转化方法在茶愈伤组织中超表达CsANS和CsLAR,结果显示其均能显著促进总儿茶素的合成,其中CsANS主要促进顺式儿茶素（EC和EGCG）含量的增加,而CsLAR主要促进反式儿茶素（C、GC、CG和GCG）的积累。推测在‘英红9号’茶树中CsANS的功能主要是促进顺式儿茶素的合成,而CsLAR更利于反式儿茶素的合成。