项目驱动式教学在微生物实验课程中的应用探索

项目驱动式教学是在教学过程中,以教学大纲内容为主线,以项目实施为手段的新型教学模式.我们课题组把项目驱动式教学在微生物实验课程中加以应用,以学生为教学中心,培养学生形成自主学习和创新性思维,锻炼学生动手操作实验的能力.     

细脚拟青霉腺苷酸琥珀酸合酶基因的克隆与表达分析

腺苷酸琥珀酸合酶(ADSS)为细脚拟青霉(Paecilomyces tenuipes)有效成分腺苷合成代谢途径的关键酶,而细脚拟青霉中腺苷酸琥珀酸合酶基因Ptadss的克隆与序列分析鲜见相关报道。本文在细脚拟青霉转录组测序结果的基础上,利用PCR技术克隆得到该菌Ptadss基因的cDNA序列,对Ptadss基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析(相关理化性质、结构域、亲水性-疏水性、亚细胞定位、信号肽和高级结构等),并构建PtADSS与相关微生物ADSS的系统进化树。同时,采用实时荧光定量PCR技术,分析Ptadss基因在不同发酵阶段的细脚拟青霉菌丝体中的表达量,以初步明确该基因的表达量对于细脚拟青霉腺苷含量的影响。结果表明:克隆得到的Ptadss基因的ORF序列为1 670bp。该基因编码的蛋白的基本性质为:423个氨基酸残基、相对分子量为46.7 663kDa、等电点(pI)为5.59,含58个磷酸化位点,且该蛋白为定位于细胞质中的非分泌性和非跨膜的疏水性蛋白。结构预测结果表明该蛋白是由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成的复杂结构。序列分析结果提示,细脚拟青霉Ptadss基因与Cordyceps confragosa腺苷酸琥珀酸合酶基因同源性最高,可达91%。结合其他微生物的ADSS氨基酸序列构建系统树,结果表明细脚拟青霉与Cordyceps confragosa亲缘关系较近。另经对不同发酵阶段的细脚拟青霉中Ptadss的表达量及腺苷含量分析结果表明:Ptadss基因的表达水平与菌丝体中腺苷含量存在正相关性。     

红花花瓣总RNA提取方法的比较研究

红花花瓣富含多糖、多酚和花色素苷等次生代谢产物,严重影响花瓣总RNA的提取。为探索适合红花花瓣总RNA的提取方法,以4种红花不同时期的花瓣为材料,通过对4种RNA提取方法,即RNA提取试剂盒、RNAiso Plus试剂法、改良的CTAB法和SDS法进行比较研究。结果表明:RNAiso Plus试剂法效果最好,提取的总RNA完整性好,纯度高、浓度高。通过RT-PCR验证,所提取的RNA达到基因克隆和实时定量PCR等分子生物学实验要求。     

红花油体体外稳定性的研究

油体属于储藏脂肪的亚细胞单位,它的表面覆盖一层磷脂和油体蛋白,具有非常稳定的结构。文章以红花油体为研究对象,从PBS、NaOH、ddH2O、Tricine和Tris-HCl中筛选出最适合红花油体的提取溶剂并且制备了红花油体悬浮液,考察了不同条件下的红花油体悬浮液体外稳定性。结果表明:通过分析红花油体提取率、粒径和电位,确定PBS为红花油体最佳提取溶剂,在提取的过程中对不同料液比进行比较,确定红花油体提取的最佳料液比为1∶10。同时,考察了pH、盐离子浓度、表面活性剂、处理温度对油体体外稳定性的影响,确定了油体在体外稳定存在的pH为8,盐离子浓度为100 mmol/L,咪唑啉阳离子表面活性剂对红花油体悬浮液稳定效果较好,在合适的pH、盐离子浓度和表面活性剂存在的条件下红花油体悬浮液可以在一定时间内保持稳定存在。