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为了制备草鱼重组TAB1蛋白(rCiTAB1)及其特异性抗体,首先以草鱼头肾组织c DNA为模板,PCR扩增Ci TAB1基因全长序列,并依次构建重组克隆质粒p MD19-T-Ci TAB1与重组表达质粒pET-32a-Ci TAB1。该重组表达质粒经0.5 mmol·L~(-1) IPTG,37℃诱导表达12 h后获得以包涵体形式表达的重组CiTAB1蛋白(rCiTAB1)。然后,采用3种不同方法对包涵体蛋白进行变性,发现与高浓度尿素直接变性法和洗涤后尿素变性法相比,洗涤后梯度尿素变性法处理后的蛋白纯度最好,经透析复性后得到浓度为2 mg·mL~(-1)的r Ci TAB1。最后,将rCiTAB1蛋白与白油佐剂及免疫增强剂混合,室温下混合1.5h乳化成免疫原,3次免疫新西兰大白兔制备兔抗CiTAB1抗体,经间接ELISA方法和免疫琼脂双向扩散试验测得免疫后第33天血清中特异性抗体的效价分别为1∶1 048 576和1∶16。Western blot检测到一条分子量约为72 kDa的特异性条带,表明该抗体能特异性识别r Ci TAB1蛋白。研究结果为后续深入研究CiTAB1蛋白功能提供了物质基础。 相似文献
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采用表型鉴定与细菌16S rRNA基因序列分析对从患病草鱼体内分离的病原菌株16-1进行分类鉴定,综合该菌株的表型特征与16S rRNA基因序列,确定其为维氏气单胞菌。随后,对该菌株的细胞黏附特性及其携带的黏附素基因进行检测与分析。结果显示,分离菌株能以聚集性方式黏附于鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)周围,平均黏附菌数随共孵育时间延长而增加,90 min达到峰值,说明该分离株具有良好的细胞黏附性。黏附因子检测表明,该菌株同时携带ompAI、ompAII和ahl13种黏附素基因,这些黏附素基因在分离菌株与不同来源参考株之间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别介于95.8%~99.5%和95.0%~100%(ompAI),96.3%~99.1%和97.9%~100.0%(ompAII),78.6%~99.6%和75.5%~99.4% (aha1),说明所携带的ompAI和ompAII黏附素基因在不同来源的维氏气单胞菌之间具有较高的保守性。 相似文献
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草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
为了建立草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定方法,本研究在采用刮除法结合胶原酶IV消化法制备肠黏膜固有层单细胞悬液的基础上,使用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒分离肠巨噬细胞,再经差异贴壁法纯化肠巨噬细胞,最后,用含10%胎牛血清和5%草鱼血清的RPMI 1640完全培养液,在28°C、5%CO2条件下原代培养肠巨噬细胞,并通过细胞形态学检查、分子标记检测和功能验证实验加以鉴定。结果显示,每尾鱼(约250 g)肠巨噬细胞的获得量约为3×107个,细胞活率为99.6%,纯度达到95%以上;倒置显微镜观察发现,原代培养4~5 d的贴壁细胞多呈圆形或多边形,体积明显增大,细胞汇合度达到95%;光镜和电镜观察到染色后的贴壁细胞具有巨噬细胞的形态结构特征,贴壁细胞经荧光定量PCR在m RNA水平检测到巨噬细胞特异性标志分子(草鱼巨噬细胞集落刺激因子受体),功能实验证实贴壁细胞具有吞噬功能,脂多糖能够显著提高其呼吸暴发活性。本研究首次成功建立了草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定方法,为开展口服疫苗诱导的草鱼肠黏膜免疫应答研究提供细胞模型。 相似文献
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于光照度0、500、2000、4000lx下,各设置4个温度梯度对脆江蓠进行培养,在实验室条件下,研究不同温度和光照度组合对脆江蓠氮、磷吸收率的影响。结果表明,上述2个环境因子对脆江蓠氮、磷吸收率均有显著影响。光照度2000~4000lx时脆江蓠对氨氮吸收率明显比0~500lx光照条件下的高,差异显著;温度对氨氮吸收率的影响规律性不明显。磷酸盐的吸收率随着温度升高而升高,并在15~20℃吸收率较好;光照度500~4000lx时脆江蓠对PO43--P的吸收率均较高,光照度对PO43--P的吸收率的影响差异不显著。 相似文献
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以大泷六线鱼为研究对象,研究了其从初孵仔鱼到幼鱼(0~100d)4种消化酶活力的变化。结果表明,大泷六线鱼的早期生长发育阶段4种消化酶呈现不同的变化趋势,随着鱼苗的生长发育,胃蛋白酶活力逐渐增大;胰蛋白酶活力整体呈现逐渐上升的趋势,0~30d内于20d时达到峰值后下降,40d后胰蛋白酶活力再次增大,并于60d时达到最大值;淀粉酶活力于20d时达到最大值后下降并呈现较平稳的变化;脂肪酶活力于5d达到最小值,40d后脂肪酶活力逐渐升高。 相似文献