通过优化gRNA设计提高CRISPR/Cas9系统中基因编辑效率的方法

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167a前体序列在线设计候选g RNA,同时结合体外编辑检测的方法筛选出能够在体外成功编辑的g RNA-G1,把其连接到含有荧光标记的pP1C.1C表达载体,转化番茄子叶,产生愈伤组织数116个,得到5个含有表达载体的材料,经测序发现,其中3个材料发生了编辑。结果表明,通过体外检测和在线软件设计相结合的方法来快速检测g RNA的编辑效率,能筛选出最优的g RNA用于载体的构建,与未采用体外编辑检测来设计g RNA的方法相比,显著提高了CRISPR/Cas9的编辑效率。本研究通过优化g RNA,创新了一种高效利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的方法。     

利用GBS技术研究240份宽皮柑橘的系统演化

【目的】GBS(genotyping-by-sequencing)是一种高效而经济的SNP(单核苷酸多态性)发掘和基因分型技术。采用GBS技术对240份宽皮柑橘进行基因分型,以阐明一些野生宽皮柑橘和地方品种的遗传背景,为其起源和演化研究提供更可靠的证据。【方法】选用国家柑橘种质重庆资源圃保存的具有广泛遗传多样性和地理起源的240份宽皮柑橘作为材料,利用Eco R I限制性内切酶消化基因组DNA后构建GBS文库;然后进行Illumina HiSeqPE150二代测序获得短读序列,通过BWA软件将序列映射到克里曼丁参考基因组上,再利用SAMTOOLS软件鉴定SNP位点。依据SNP的基因分型结果,采用邻近法构建系统演化树,并进行主成分分析。【结果】利用GBS简化基因组测序技术对240份宽皮柑橘进行测序,共获得96.3 Gb的测序数据,平均每个样本测序数据为401.26 Mb,经过测序深度为4X、Miss0.2、次要等位基因频率(MAF)0.01的筛选条件过滤,最后共获得了114 200个高质量的SNP位点。主成分分析结果显示240份宽皮柑橘被分为4大类,其中温州蜜柑亚群、野生宽皮柑橘亚群可明显区分于其他宽皮柑橘。利用系统演化树可将240份宽皮柑橘划分到11个类群中。系统演化树和主成分分析都揭示了不同地理来源和特定形态的宽皮柑橘在遗传水平上存在明显的差异,比如来源于日本的温州蜜柑、欧美的克里曼丁橘及其杂种后代,以及中国南方的野生宽皮柑橘由于地理分布不同而形成了较为独特的类型,彼此间能够相互区分开。进化树结果表明中国南、北不同地域的宽皮柑橘可能存在不同的演化路径,南岭山脉及南方地区的野生宽皮柑橘、酸橘和目前南方地区栽培的砂糖橘存在较近的起源演化联系,而北方宽皮柑橘的演化却与宽皮柑橘中的古老地方品种存在紧密联系。人工杂交育种、长期的人工选择和驯化形成了不同类型的宽皮柑橘,同时也导致宽皮柑橘遗传多样性的增加。另外,一些宽皮柑橘资源中的可疑亲本也通过GBS技术得以准确鉴定。本研究表明沃柑与金诺橘有较近的亲缘关系。【结论】GBS技术用于柑橘种质资源的基因分型高效可靠,建立的系统演化树可以对240份宽皮柑橘进行准确划分,与用植物形态学划分的结果高度吻合。另外,GBS技术用于资源材料的准确鉴定和亲缘关系的研究,可为柑橘植物新品种权的保护提供可靠的技术支撑。     

宽皮柑桔可滴定酸检测方法的对比研究

柑桔果实酸度是决定果实品质和风味的重要指标之一,目前对柑桔果实可滴定酸的测定主要是用化学检测方法,该方法耗时,无法进行高通量的检测。本研究利用近红外光谱和化学测定方法对240个宽皮柑桔品种果实的可滴定酸含量进行了连续两年的检测,通过对样品的近红外光谱与化学测定值进行拟合建模,建立了宽皮柑桔可滴定酸的偏最小二乘法（PLS）模型。结果表明,在特征波长5370-6550nm构建的PLS模型,以一阶导数+Norris消噪光谱预处理的预测效果最好,其相关系数为0.9861,RMSEC为0.0969,RMSECV为0.166,RMSEP为0.155。该模型对可滴定酸的预测值与化学测定法的测定值有极显著的相关性。参考国标采用的化学测定法,将近红光谱法与PAL-1手持测定仪进行对比分析,近红外光谱法与化学测定法具有更显著的相关性,而且在不同的酸含量范围内相关性没有明显差异。本研究的结果说明近红外光谱法具有较高的稳定性与精确度,可用于替代化学测定法对宽皮柑桔果实的可滴定酸进行高通量的精准检测。     

小菊新品种‘汴京紫精灵’

收取‘国庆红’自然授粉的种子,从实生后代中筛选出观赏小菊新品种‘汴京紫精灵’。植株低矮,株型紧凑,生长势旺。花朵繁多,半重瓣,花序直径2.7cm,花色靓丽,舌状花紫色,基部有少量乳白色,花心黄色。花期早,10月10日左右初花,10月15日左右盛花期,10月底末花期。可用于布置国庆节花坛和菊花文化节花展。     

菊花新品种‘汴京庆典黄’

‘汴京庆典黄’是由‘北京紫小菊’自然授粉的后代中选育出的菊花新品种。重瓣,盛开时花径3.5cm,舌状花金黄色。株型紧凑,花色靓丽、花朵繁多、花期长,自然花期10月初到10月末,个体、群体观赏效果俱佳,宜作园林应用,可做小菊生产主栽品种种植。     

隆昌柑橘产业现状及发展建议

隆昌市具有柑橘生产得天独厚的气候条件。近几年在隆昌市委、市政府的正确领导下,柑橘产业得到了蓬勃的发展,目前柑橘产业是隆昌的主要产业之一。为了确保隆昌柑橘产业持续健康发展,笔者通过实地调研和查阅资料,从产业发展现状、存在的问题等方面进行分析,并提出相应的发展建议。     

宽皮柑橘种质资源表型多样性分析及综合评价

【目的】分析宽皮柑橘的表型多样性和遗传变异规律,探讨柑橘种质资源的综合评价方法。【方法】本研究利用变异系数、Shannon-Weaver多样性指数及方差分析对239份宽皮柑橘的18种表型性状进行多样性分析和性状差异分析,用SPSS进行聚类分析,通过主成分、相关性以及回归分析对宽皮柑橘种质资源进行综合评价和评价指标筛选。【结果】对239份宽皮柑橘表型多样性分析,变异系数结果表明种子数、固酸比、可滴定酸含量及单果重的性状变异比较丰富,果形指数、囊瓣数及可溶性固形物含量的遗传特性相对稳定。遗传多样性指数结果表明,单果重、横径、纵径、囊瓣数、叶柄长、叶长、叶宽、还原糖含量及转化糖含量在每一级分布比较均匀,果皮光滑度、种子数及固酸比分级较少,且在每个表现型上的分布不均匀。对5个不同地理来源的宽皮柑橘资源进行方差分析,结果显示来源于美国的宽皮柑橘品种可溶性固形物和转化糖的含量平均值高于其他地理来源;来源于日本的宽皮柑橘单果重、横径和纵径大于其他地理来源,种子数显著少于其他地理来源;来源于长江流域的宽皮柑橘品种的果型、可溶性固形物、转化糖及还原糖含量大于珠江流域,但固酸比显著低于珠江流域。对野生品种、地方品种、选育品种3种不同类型的宽皮柑橘性状作方差分析,选育品种呈现果型大、果皮光滑、种子少、酸度低、糖度高等特点。系统进化树和主成分分析图均表明不同地理来源、不同类型的宽皮柑橘在遗传水平上存在明显差异,中国小果资源可作为一个独立类群,青皮蜜橘是一份独特的柑橘资源。主成分分析发现,前9个主成分的累计贡献率达81.94%,表明这9个主成分包含了宽皮柑橘表型性状的大部分信息。表型性状的综合评价分析表明,239份宽皮柑橘综合评价F值均值为0.480,来源于日本的爱媛21号的F值最高(0.664),来源于日本的扁橘F值最低(0.211)。18个表型性状与综合值F的相关性分析结果表明,除了果皮光滑度外的17个表型性状数据均与F值呈极显著相关。采用逐步回归分析方法,筛选出9个表型性状:纵径、果形指数、果皮光滑度、囊瓣数、叶柄长、叶宽、可溶性固形物含量、可滴定酸含量以及还原糖含量。【结论】宽皮柑橘种质资源具有较高的表型多样性,不同地理来源、不同类型的宽皮柑橘性状存在差异,筛选出的9个表型性状可作为宽皮柑橘的综合评价指标。     

宽皮柑桔可滴定酸检测方法的对比研究

柑桔果实酸度是决定果实品质和风味的重要指标之一。目前对柑桔果实可滴定酸的测定主要是采用我国国家标准《柑桔鲜果检验方法》(GB/T 8210—2011)规定的酸碱滴定法(化学法),该方法耗时,无法进行高通量检测。本研究利用近红外光谱法和化学法对240个宽皮柑桔品种果实(果汁样品)可滴定酸含量进行了连续两年的检测,通过对样品近红外光谱数据与化学法测定值进行拟合建模,建立了宽皮柑桔可滴定酸含量近红外光谱检测的偏最小二乘回归(PLS)模型。结果表明,选取特征波段(波数6 550～5 370 cm^-1)光谱构建PLS模型时,以一阶导数+Norris消噪进行光谱预处理的效果最好,模型的相关系数为0.986 1,RMSEC为0.096 9,RMSECV为0.116,RMSEP为0.155。该模型对可滴定酸的预测值与化学法测定值有极显著(p<0.001)的相关性。以化学法为基准,将近红光谱法与PAL-1手持测定仪法进行对比分析的结果表明,近红外光谱法与化学法具有更高的相关性,而且在不同的酸含量范围内相关性没有明显变化。说明,近红外光谱法具有较高的稳定性与精确度,可替代化学法...     

甘平在重庆北碚的引种表现及栽培技术

国家柑橘种质资源圃2012年从韩国济州引进杂柑品种‘甘平’于重庆北碚进行试栽,经过连续3年对其植物学特性、结果习性进行观察,该品种果形漂亮、果实大小整齐美观、内质优良,但果皮薄导致裂果容易发生,生产中需要加强对裂果的防范,该品种可作为高档礼品果或采摘观光果品进行发展。     

宽皮柑桔野生和地方资源遗传多样性分析

本研究利用SSR、InDel及来自于lncRNA的分子标记对我国不同地区的45份野生、半野生及地方宽皮柑橘资源进行了遗传多样性分析。31对引物共获得81个标记位点,产生了280条多态性条带,平均每对引物检测到 9条扩增条带,多态性标记位点的平均香农信息指数为0.651,平均期望杂合度为0.385。群体遗传结构、主坐标轴和聚类分析均表明,莽山野柑是一类原始独特的柑橘种质;起源于南岭山脉的野生宽皮柑橘,如道县野桔、悬崖野桔、莽山桔、江永野桔、崇义野桔等构成了一类独特于其它宽皮柑橘的原始野生类群;古老栽培柑橘中的皱皮柑类型,包括旺苍皱皮柑、皱皮柑、藏橘等构成了另一个原始古老类群,现代栽培柑橘城固冰糖桔中具有典型皱皮柑的基因渗入。宽皮柑橘中的一些育成品种及杂柑资源,具有较丰富的遗传多样性。本研究证实了起源于南岭山脉一带的野生宽皮柑橘在遗传背景上较为接近,其多样性也低于现代栽培宽皮柑橘,缺乏人为驯化和外源基因渗入,为南岭山脉是我国宽皮柑橘的起源中心这一论断提供了科学依据。由于长期的人为驯化和外源基因的渗入,宽皮柑橘的演化伴随着遗传多样性水平由低向高逐渐演变的过程。