柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

四川省攀西地区南瓜、甜菜和辣椒部分病毒种类的ELISA检测

利用马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）和马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）的多克隆抗体,以及烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV-2）及芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）的单克隆抗体,采用抗原直接包被ELISA法对四川省攀枝花、西昌和德昌地区的南瓜、甜菜和辣椒上采集的病毒病样品进行了检测。结果表明,在87份样品中PVY的侵染最普遍,总检出率达74.71 %|CMV、TMV、TuMV、BBWV-2和PVX的总检出率分别为12.64 %、13.79 %、22.99 %、10.34 %和14.94 %。在87份样品中,仅发现TuMV、PVX及PVY的单独侵染|其余25份样品均检测到2种以上病毒的复合侵染,总检出率为34.72 %。表明攀西地区蔬菜上病毒复合侵染现象普遍,PVY是该地区蔬菜上的优势毒原。     

河南省番茄黄化曲叶病病原分子鉴定及全基因组序列分析

利用双生病毒简并引物PA/PB对采自河南中牟县13份表现为黄化、曲叶症状的番茄样品进行PCR检测, 结果发现11份样品检测呈阳性,检出率为84.6%.选取样品HN-158,利用滚环扩增PCR(RCA-PCR)、克隆、测 序等技术获得病毒基因组DNA-A全序列,该DNA分子全长为2781nts(登录号JQ004028.1),与已报道的番茄黄 花曲叶病毒Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV山东泰安分离物SDTA(NCBI登录号:JF414236.1)核酸序列 相似度最高,为99.8%.进化分析表明,该病毒分离物与来自菏泽、泰安、济南、石家庄及天津等地的TYLCV 分 离物亲缘关系较近.以上结果表明中牟县田间番茄黄化曲叶病样品均受到TYLCV 侵染,该病毒分离物可能来源 于我国山东番茄上的TYLCV.     

四川米易赛葵上粉虱传双生病毒的分子鉴定及复合侵染检测

为了明确四川米易赛葵上的双生病毒种类及复合侵染情况,基于滚环扩增PCR（RCA-PCR）技术,利用双生病毒DNA-A、DNA-B及卫星DNA的通用引物对四川米易表现黄脉症状的12个赛葵样品进行了检测,并对其序列进行分析。双生病毒的检出率高达92%;共检出云南赛葵黄脉病毒（Malvastrum yellow vein Yunnan virus,MYVYNV）、赛葵黄脉病毒（Malvastrum yellow vein virus,MYVV）及中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）等3种双生病毒,复合侵染率高达67%;11个阳性样品中共检测到两类卫星DNAβ分子,分别与MYVYNV伴随的DNAβ（MYVYNB-[Y160],98.4%～98.7%）和MYVV伴随的DNAβ（MYVB-[Y197],98.5%～98.7%）的序列相似性最高;未扩增到DNA-B及DNAα分子。表明病毒DNA-A与卫星DNAβ以病害复合体形式存在,且DNAβ可伴随异源辅助病毒。