重组逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子基因转移与哺乳动物细胞表达

以构建的重组肿瘤坏死因子逆转录病毒载体ｐＺＩＰＴＮＦ ＤＮＡ转染Ｃｏｓ７细胞，获得了ＴＮＦα暂时性表达。采用ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法，将ｐＺＩＰＴＮＦ ＤＮＡ导入了单向性逆转录病毒包装细胞ψ２，在Ｇ４１８选择下，克隆出了ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞系。该细胞可产生重组ＴＮＦ逆转录病毒。本研究利用ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞分泌的重组逆转录病毒连续传代感染ψ２或ＰＡ３１７细胞以及病毒交替感染ψ２和ＰＡ３１７细胞，     

pCMV－TNFα的构建及其在动物细胞中的表达

以ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲＶ双酶消化ｐＢＴ１获得肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ基因片段，以ＸｂａⅠ和ＳｍａⅠ酶切点定向克隆入质粒载体ｐＣＭＶ４，构建了人ＴＮＦα重组质粒ｐＣＭＶ－ＴＮＦα。采用ＤＮＡ—磷酸钙共沉淀法转染ＣＯＳ７和ＮＩＨ３Ｔ３细胞，收集转染后不同时间的细胞培养上清，检测ＴＮＦα的表达水平和生物学活性。ＥＬＩＳＡ检测表明，两种细胞转染后，其培养上清中均有ＴＮＦα抗原存在，而载体等对照则测不出ＴＮＦα。以Ｌ９２９细胞检测其细胞毒活性，发现ＣＯＳ７细胞于转染后４８ｈ表达水平最高，活性高达１６Ｕ／ｍＬ以上，但７ｄ时测不出ＴＮＦα活性；ＮＩＨ３Ｔ３细胞于转染后２４ｈ活性最高（８Ｕ／ｍＬ），９ｄ时尚有表达，但不足１Ｕ／ｍＬ。     

pCMV—TNFα的构建及其在动物细胞中的表达

以Ｘｂａ Ｉ和Ｅｃｏ ＲＶ双酶消化ｐＢＴ１获得肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ基因片段，以Ｘｂａ Ｉ和Ｓｍａ Ｉ酶切点定向克隆入质粒载体ｐＣＭＶ４，构建了人ＴＮＦα重组质粒ｐＣＭＶ－ＴＮＦα。采用ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法转染ＣＯＳ７和ＮＩＨ３Ｔ３细胞，收集转染后不同时间的细胞培养上清，检测ＴＮＦα的表达水平和生物学活性。ＥＬＩＳＡ检测表明，两种细胞转染后，其培养上清中均有ＴＮＦα抗原存在，而载体等