MicroRNA研究概述

MicroRNA(miRNA)是一类真核生物内源性非编码的单链小分子RNA,长约21nt~23nt。越来越多的miRNA在动物细胞和植物组织中发现,这些成熟的小分子RNA是从具有发夹结构的前体miRNA(pre-miRNA)剪切出来,通过与靶mRNA分子互补结合而抑制蛋白翻译或导致mRNA降解,从而调控靶基因的表达。miRNA是一类重要的基因调控子,在机体的基因表达调控、细胞分化和凋亡以及抗病毒防御中发挥重要的作用。深入理解miRNA介导的宿主与病毒之间的相互调节作用,对于阐明病毒的致病机理与制定治疗策略具有深远的意义。     

不同规模猪场O型口蹄疫免疫抗体监测和效果分析

按100头以上和100头以下母猪的标准,从广西4市27家养殖场分别采集已经免疫过口蹄疫疫苗后1个月的仔猪、肉猪和母猪血清1 080份,使用阻断ELISA方法对样品的抗体水平进行检测。结果:100头母猪以上的猪场抗体合格率和100头母猪以下猪场差异极显著。抗体离散度均较高,均不符合要求。使用合成肽疫苗比灭活疫苗能产生较好的抗体,差异显著。结果提示,应该加强对种猪的口蹄疫免疫,根据个体的抗体消长规律进行有针对性的免疫,以达到提高群体抗体均匀度。     

小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系的建立

[目的]建立Toll样受体3(TLR3)基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据.[方法]采用Golden Gate Kit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)打靶载体pTALEN-TLR3,经酶切和测序验证其连接正确后,通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞,转染后提取细胞DNA,用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性.[结果]TALENs左右臂分两部分连接,首先完成A、B部分的各自连接,然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接,TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示,T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性,T2R有3个克隆呈阳性.T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板,经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切,酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强,共获得3条条带(931、555和376 bp).TALEN打靶载体pTALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24 h后用胰酶进行消化,并加入800μg/mL G418进行筛选,7 d后获得细胞单克隆;挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序,结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系,均缺失7 bp的核苷酸碱基,为非3整数倍碱基缺失,可造成后续基因移码突变,使细胞基因功能失活.[结论]通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系,且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究.     

田东县中小猪场猪瘟免疫抗体水平监测

[目的]了解田东县中小猪场不同猪群的猪瘟免疫状况,为田东县防控猪瘟提供科学依据.[方法]试验选择田东县10个乡镇10个猪场,采集免疫21 d后的经产母猪、仔猪、生长育肥猪血清样本,应用阻断ELISA方法对采集血清样品进行猪瘟免疫抗体检测,比较相同疫苗不同胎次母猪群、相同疫苗不同免疫次数仔猪群、使用4种不同病毒含量(A组750RID、B组7500RID、C组20000RID、D组30000RID)猪瘟细胞苗的生长育肥猪群抗体水平.[结果]经产母猪群抗体阳性率为83.61％,总离散度为45.97％,7胎及7胎以上母猪群猪瘟免疫抗体阳性率最低,为58.33％.仔猪的一免免疫抗体阳性率为52.17％,低于国家规定标准(≥70％);二免免疫抗体阳性率为81.82％,显著高于国家规定标准,比一免抗体阳性率提高了29.65百分点.4种不同病毒含量猪瘟细胞苗免疫生长育肥猪在末次免疫21 d后,均产生较好的免疫效果,但不同病毒含量猪瘟疫苗之间存在一定差异.[结论]经产母猪群抗体离散度较大,仔猪一次免疫后抗体水平低于保护值,不同病毒含量猪瘟疫苗免疫效果存在一定差异.研究结果为进一步提高猪瘟免疫水平提供了依据.     

狂犬病病毒GX074株P蛋白48～78位区域氨基酸联合M蛋白突变株的构建及特性研究

为探究广西狂犬病病毒街毒GX074株P蛋白联合M蛋白对生物学特性的影响,实验以构建的弱毒疫苗株rRC-HL感染性cDNA克隆质粒pRC-HL为基础,将GX074株P蛋白的48～78位区域氨基酸及M蛋白联合替换到pRC-HL相同位置,进行突变病毒的拯救,经间接免疫荧光实验及序列测定获得突变体rRC-HL(GX074P^48～78M)。结果表明,突变体病毒rRC-HL(GX074P^48～78M)基因组稳定,拯救后的荧光灶小于亲本弱毒rRC-HL株,大于亲本强毒GX074株及CVS-11株;在细胞中的复制能力表现出与rRC-HL株相似的特点,多步生长曲线显示突变体病毒滴度略低于rRC-HL,而稍高于GX074株及CVS-11株。说明突变体毒株rRC-HL(GX074P^48～78M)相较于亲本弱毒rRC-HL株复制能力有所降低,比亲本强毒GX074株复制能力略高。     

2012～2014年广西猪蓝耳病疫苗的免疫副反应分析

为了了解高致病性猪蓝耳病疫苗使用的免疫副反应情况,调查了广西部分地区2012 ～2014年使用8个疫苗生产厂家的猪蓝耳病疫苗的免疫副反应情况,并对不同年度、厂家,不同类型疫苗的副反应情况进行分析.结果表明,不同年度的副反应情况呈下降趋势;不同疫苗厂家生产的疫苗对应激反应有一定的差异;活苗和灭活苗的副反应差异显著.若要降低免疫副反应,防治人员的素质是重要的影响因素,应全面做好免疫前的准备工作,并根据猪群的健康状况调整免疫程序对降低免疫副反应有重要意义.     

广西部分地区猪群主要疫病免疫抗体监测和免疫效果分析

从广西5个地市33家养殖场随机采集免疫过猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪瘟(CSF)、猪伪狂犬病(PR)疫苗的血清样品393份,使用免疫胶体金方法对样品的抗体水平进行检测。结果显示,不同养殖规模的猪场抗体阳性率总体较高的是猪瘟,达75.06%;其次是猪伪狂犬病,为71.25%;而猪繁殖与呼吸综合征抗体最低,仅为42.24%。各种病原抗体在不同规模的猪场有较大的差别,规模猪场的猪群某些疫病的抗体未必比散养猪群高。通过对不同类型的疫苗所产生的抗体水平进行比较,结果发现,使用猪繁殖与呼吸综合征灭活苗和弱毒苗、猪瘟脾淋苗和细胞苗、猪伪狂犬病国产苗和进口苗免疫所产生的抗体水平没有明显差异。     

羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α实时荧光定量检测方法的建立

为探讨羊痘病毒感染后机体的凋亡细胞因子mRNA表达水平的变化,深入探讨羊痘病毒免疫机制,本研究设计针对羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α特异性引物,建立羊凋亡细胞因子实时荧光定量方法。分别建立荧光定量PCR反应体系并进行优化。结果表明:Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰。组内变异系数均小于2.00%。本研究建立的羊凋亡细胞因子SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法为凋亡细胞因子mRNA表达水平提供了技术平台。     

鹅源新型鸭呼肠孤病毒广西株G-NDRV-GX-2022全基因组分子特征的分析

为研究鹅源新型鸭呼肠孤病毒的全基因组分子特征及其广西流行株的进化特点,本研究采集广西地区3份发病鹅的肝脏、脾脏、肺脏及肾脏病料样品,采用多重荧光定量RT-PCR (RT-qPCR)检测番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和新型鸭呼肠孤病毒(NDRV),并以NDRV阳性样品的核酸为模板,采用RT-PCR分段扩增其全基因组并测序,采用BioEdit软件分析其全基因组序列的相似性;采用NetNGlyc 1.0软件预测NDRVσC蛋白N-糖基化位点;通过Mega 7.0软件绘制σ系列基因的系统发育树及RDP5和SimPlot软件分析NDRV全基因组的重组事件。RT-q PCR结果显示,检出1份NDRV阳性样品,经测序及序列拼接,获得一条鹅源NDRV广西流行株G-NDRV-GX-2022全基因组序列,全长23 353 bp,分为L1～L3、M1～M3及S1～S4共10个基因;BlAST分析结果显示,G-NDRV-GX-2022株10个基因与GenBank中相应基因序列的相似性最高为91.2%～98.4%,对应的病毒株均源自中国广东、福建、山东、浙江及湖北等地的NDRV,宿主有野鸭、番鸭、绿头鸭等,表明G-...