鸡内参基因β-actin和GAPDH实时定量PCR重组质粒标准品的构建

本研究从SPF鸡皮肤中提取总RNA,并反转录为cDNA;以该cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增出看家基因β-actin和GAPDH,将PCR产物连入pGEM-T easy载体,转化DH5α菌,经蓝白斑筛选和质粒酶切鉴定和DNA含量测定,得到定量的β-actin和GAPDH基因融合的重组质粒(pGEM T-actin和pGEM T-GAPDH),即实时定量PCR内参标准品.构建成功的标准品经10倍梯度稀释,作为模板,获得扩增效率良好及可信度高的标准曲线.构建成功的标准品可大量制备,可用于鸡的靶基因定量PCR所需的内参标准品.     

双向电泳分析鸡羽髓蛋白组学方法的建立

为建立双向电泳方法研究鸡羽髓蛋白组学,以进一步了解病毒与宿主相互作用的新机制,从SPF鸡羽根挤出羽髓,提取其中蛋白进行双向电泳,并对不同裂解液、IPG胶条pH值范围、一向等电聚焦条件、二向SDS-PAGE凝胶浓度等影响因素进行优化.结果显示,采用17cm,pH 5～8 1PG胶条,400μg羽髓蛋白进行的双向电泳,图谱用PDQuest8.0.1分析,可分辨的蛋白点约为700左右,不同样本间的匹配率大于80%.可见,本研究建立的双向电泳方法分辨率及重复性均较高.