广西沼泽型水牛IL-18和TNF-α基因的克隆与序列分析

从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单核细胞(PBMCs),用刀豆素A(ConA)诱导培养3,8和12 h后,提取细胞总RNA,以Oligo(dT)18为引物合成第一链cDNA,根据牛的白细胞介素18(IL-18)和绵羊的肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因序列设计2对特异性引物,通过PCR方法扩增出水牛IL-18和TNF-α基因,将其克隆到pMD18-T载体,测序后进行序列分析。结果试验中所克隆到的IL-18和TNF-α基因序列的开放阅读框(ORF)分别为602 bp和715 bp,与GenBank所登录的水牛IL-18和TNF-α核苷酸序列同源性为99.1%和99.7%,其推导的氨基酸序列同源性分别是99.0%和98.7%。表明成功从水牛外周血中克隆到了水牛IL-18和TNF-α基因。     

奶牛附红细胞体感染PCR诊断方法的建立

为建立特异、敏感、快速的奶牛附红细胞体感染诊断方法，该研究根据本实验室已测得的奶牛附红细胞体16S rRNA基因序列，设计1对种特异性引物，建立了奶牛附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验结果表明，该诊断方法与猪肺炎支原体、鸡毒支原体、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫无交叉反应，能检测的奶牛附红细胞体最低DNA量为0．154fg，同时能检测出在4℃存放长达3个月的血样。通过临床血样检测，证明该方法可用于本病的早期诊断。     

广西沼泽型水牛IL-4和IL-5基因的克隆及其序列分析

从刀豆素A(Concanavalin A,ConA)刺激的广西沼泽型成年水牛外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cells,PBMCs)中提取总RNA,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增出白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)和白细胞介素-5(IL-5)基因,分别克隆到pMD18-T载体上,进行序列分析。结果表明,从培养9 h、17 h的单个核细胞中扩增得到的IL-4基因在核苷酸水平上与GenBank上登录的印度水牛IL-4 cDNA序列同源性为98.8%,与牛、绵羊、猪和马的同源性分别为99.3%、94.1%、84.8%和80.6%;氨基酸水平的同源性分别为96.3%、98.5%、90.4%、78.4%和59.6%。从培养12 h的单个核细胞中扩增得到的IL-5基因在核苷酸水平上与GenBank上登录的牛、绵羊、猪和马IL-5 cDNA序列同源性分别是99.0%、96.5%、89.6%和89.1%;氨基酸水平的同源性分别为97.8%、96.2%、85.9%和86.7%。本研究为进一步了解水牛IL-4和IL-5的结构和水牛免疫学特性奠定了基础。     

广西沼泽型水牛γ-干扰素基因的克隆与原核表达

本研究克隆了广西沼泽型水牛γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)基因,并构建了水牛IFN-γ原核表达质粒。从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用刀豆素A(Concanavalin A,ConA)诱导培养13 h后,提取细胞总RNA,用水牛IFN-γ基因特异性引物通过RT-PCR扩增水牛IFN-γ成熟肽编码区cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中。RT-PCR产物电泳可见约457 bp大小目的片段。经过限制性酶切分析,测序证实克隆得到的基因序列正确。将IFN-γ成熟肽编码区基因片段切下亚克隆到表达载体pET-32a 中,构建成重组表达质粒pET-mIFN-γ。PCR、双酶切电泳和序列测定结果均证实已插入约457 bp的IFN-γ基因片段。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,水牛IFN-γ基因在大肠杆菌中获得了高效的表达,融合蛋白的分子量为35 ku,表达量占菌体总蛋白的43.6%。     

水牛白细胞介素-2基因的克隆及其序列分析

根据GeneBank上发表的牛IL-2基因序列,设计一对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激培养9h、17h的沼泽型水牛外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出水牛IL-2基因.琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为724bp,分离纯化,克隆到pMD18-T载体.经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,以及核苷酸测序结果显示,克隆的水牛IL-2基因与GeneBank上发表的序列同源性为99.8%.     

广西沼泽型水牛白细胞介素-10和干扰素-γ基因的克隆及其序列分析

将本地沼泽型成年水牛外周血单核细胞(PBMC)在刀豆素A(ConA)的刺激下体外培养,提取培养的单核细胞总RNA,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增水牛白细胞介素-10(IL-10)和干扰素-γ(IFN-γ),并克隆到pMD18-T载体上,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定筛选阳性克隆,然后进行测序。序列分析结果显示:IL-10开放阅读框(ORF)由536个核苷酸组成,共编码178个氨基酸;在核苷酸水平上与印度水牛、牛、绵羊、猪、马、人和鼠的IL-10基因的同源性为75.9%～99.6%;氨基酸的同源性为74.2%～100%。IFN-γ的ORF由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸;在核苷酸水平上与印度水牛、牛、绵羊、猪、马、人和鼠的IFN-γ基因的同源性为60.7%～99.6%;氨基酸的同源性为40.6%～100%。