猪A组轮状病毒Vp4基因与乳酸菌双标记表达载体的重组及其原核表达

用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和(以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)及红霉素基因(Erythromycin)为选择压力的双标记的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的)质粒载体pW425et,并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-VpC,并将pW425et-Vp4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13和乳酸杆菌感受态中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87 ku的融合蛋白.Western-blot分析结果表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性.     

"食品级"乳酸菌表达载体系统的研究进展

目前,多数外源基因的克隆与表达,主要采用大肠杆菌.然而,由于大肠杆菌能够引起人类和动物发生不同程度的腹泻,导致机体损伤,所以其表达产物需要经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准.     

乳酸菌Nisin诱导表达载体的构建和鉴定

为构建乳酸菌Nisin诱导表达载体,实现外源目的基因在乳酸菌中的可控表达,本研究以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增双组份调控元件nisRK基因和诱导型启动子nisA基因,并克隆至乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pW425et中,以nisA基因替换原组成型启动子P32,构建乳酸菌Nisin诱导表达载体pW425N。为检测载体的诱导表达功能,以gfp基因作为报告基因,构建重组表达载体pW425N-gfp,以分离自仔猪肠道内嗜酸乳杆菌为受体菌,电转化法制备重组乳酸菌pW425N-gfp/L.acidophilus。结果表明,重组载体能够在Nisin诱导下表达目的荧光蛋白,并且最佳Nisin有效浓度为30 ng/mL,最佳诱导时间为3 h。该表达载体的构建为外源功能性蛋白在乳酸菌中的诱导表达奠定基础。     

不同年龄花羔红点鲑肌肉成分和血液指标的比较研究

对不同年龄花羔红点鲑(Salvelinus malma)肌肉成分和血液指标的分析结果表明,鱼体肌肉水分含量随年龄增长呈下降趋势,粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量呈逐渐升高趋势.不同年龄花羔红点鲑肌肉氨基酸种类完全相同,各种氨基酸含量在各龄鱼间均未见显著差异(P=>0.05);肌肉脂肪酸含量高,不同年龄花羔红点鲑肌肉脂肪酸除十八碳二烯酸中C18:3-γ含量差异不显著外(P>0.05).其他各脂肪酸含量均随年龄增长而呈显著增加趋势(P<0.05).研究发现,不同年龄花羔红点鲑血液生理生化指标中除红细胞渗透脆性、血清总蛋白、白蛋白和球蛋白含量无显著变化(P>0.05)外,其他各指标均有显著性差异(P<0.05).实验结果表明,与其他龄鱼相比较,4龄鱼营养价值较高.[中国水产科学,2009,16(1):113-119]     

牛乳中乳酸乳球菌nisRK基因的克隆与序列分析

以一株分离自牛乳中乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增出乳链菌肽生物合成的双组分调控元件(nisRK基因)。试剂盒回收纯化nisRK基因后将其克隆入以氨苄青霉素为选择压力的pGEM-T克隆载体中,再转化E.coliDH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取重组体,进行酶切鉴定和PCR鉴定,并对nisRK基因进行序列测定,与已知序列进行同源性比较。结果表明成功地克隆出nisRK基因,全长为2 035 bp,与国外报道的nisRK基因同源性高达99.9%。     

猪A组轮状病毒Vp4基因与乳酸菌双标记表达载体的重组及其原核表达

用Sal I和Kpn I双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和(以胸苷酸合成酶基因(thvmidvlatesynthase,thyA)及红霉素基因(Erythromycin)为选择压力的双标记的可以在乳酸茵与大肠杆菌之间穿梭表达的)质粒载体pW425et,并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸茵与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-Vp4,并将pW425et-VP4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13和乳酸杆菌感受态中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87 ku的融合蛋白.Western-blot分析结果表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性.     

口服猪A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌对BALB/c小鼠的免疫保护作用

将轮状病毒pW425et-Vp4乳酸菌重组质粒口服免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间眼球采血脱臼处死,收集小鼠血清、脾细胞及肠道内容物,用ELISA方法检测血清IgG水平,用试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,以流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群和CD19+B细胞亚群的变化情况,最后进行攻毒试验。结果显示,pW425et-Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠血清IgG及肠黏膜SIgA水平较对照组有明显差异,且S/N2.0,CD4+/CD8+比值显著高于对照组,且比值大于2:1;表明猪A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌重组表达质粒可以增强小鼠机体免疫保护能力。     

2种乳酸杆菌肠道黏膜免疫调节作用的比较

【目的】比较嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)肠道黏膜免疫调节作用的差异。【方法】以C57BL/6小鼠为受试动物,分别灌胃嗜酸乳酸杆菌和植物乳酸杆菌7d后取材,采用流式细胞术、ELISA等方法,对脾脏和肠系膜淋巴结中T细胞亚群、结肠PP结中TLR2+和TLR4+细胞、结肠组织中IFN-γ和IL-4水平及小肠sIgA水平进行检测,明确2种乳酸杆菌对肠道黏膜的免疫调节作用。【结果】2种乳酸杆菌对小鼠体质量无显著影响。2种乳酸杆菌均可显著提高小鼠肠系膜淋巴结中CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞比例,且与嗜酸乳酸杆菌相比,植物乳酸杆菌更倾向于提高CD3+CD8+T细胞比例;而与对照组相比,二者对脾脏中CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞比例均无显著影响。2种乳酸杆菌均可极显著提高结肠PP结中TLR2+细胞比例,而对TLR4+细胞比例无显著影响。2种乳酸杆菌均可极显著提高结肠组织中IFN-γ水平,嗜酸乳酸杆菌还可极显著提高IL-4水平。2种乳酸杆菌均能显著提高肠道黏膜sIgA水平。【结论】2种乳酸杆菌均可提高结肠PP结中TLR2+细胞比例,嗜酸乳酸杆菌上调Th1和Th2型免疫反应,植物乳酸杆菌上调Th1型免疫反应。     

表达EPEC紧密素蛋白重组嗜酸乳酸杆菌的免疫效果检测

【目的】制备抗肠致病性大肠杆菌(EPEC)的重组嗜酸乳酸杆菌,并初步探索其免疫效果。【方法】采用DNAStar软件选取EPEC E2348/69的eae全基因中抗原性较高的984bp片段(编码328个氨基酸残基,命名为eae Int328)为目标序列,以EPEC E2348/69基因组为模板,PCR扩增eae Int328基因,构建重组表达载体pSIP409-eae Int328,电转化法获得相应的重组嗜酸乳酸杆菌,采用SppIP诱导重组菌表达,并通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白。以BALB/c雌性小鼠为受试动物,灌胃重组嗜酸乳酸杆菌15d后,再灌胃EPEC,第21天,取结肠PP结和肠内容物,15和21d称体质量,同时设PBS(对照)、EPEC和pSIP409空载体转化嗜酸乳酸杆菌处理。采用流式细胞术检测结肠PP结中的CD11c+DC、CD4+T、CD19+B细胞比例,采用ELISA检测肠内容物中的特异性sIgA水平。【结果】克隆得到了984bp的eae Int328基因,构建了重组质粒pSIP409-eae Int328,制备了相应的重组嗜酸乳酸杆菌,用SppIP诱导表达后,重组嗜酸乳酸杆菌表达了分子质量约为36ku的重组蛋白,该重组蛋白与eae单克隆抗体可发生特异性结合。与EPEC和pSIP409空载体转化嗜酸乳酸杆菌组相比,21d时,pSIP409重组嗜酸乳酸杆菌组小鼠体质量显著增加,且与PBS组小鼠无显著差异。该重组嗜酸乳酸杆菌可显著提高BALB/c小鼠结肠PP结中的CD19+B细胞比例,极显著提高结肠PP结中的CD11c+DC和CD4+T细胞比例,使肠道黏膜产生针对EPEC的特异性sIgA。【结论】pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌通过CD11c+DC的介导,促进CD4+T细胞数量增加,进而诱导B细胞活化产生针对EPEC的特异性sIgA,进而对小鼠EPEC的急性感染发挥作用。