猪囊虫病基因工程疫苗的研制及应用

从猪带绦虫六钩蚴cDNA文库中筛选目的基因并进行克隆表达，重组抗原用血清学方法和猪体免疫试验进行鉴定，筛选保护性抗原基因。将具有免疫保护作用的重组抗原纯化，并与免疫刺激复合物佐剂结合，制成猪囊虫病基因工程疫苗。对工程菌的培养发酵、重组抗原的下游纯化及疫苗的配制、疫苗的中间试制进行了研究，确定了一套比较完善的生产工艺。应用昆明小鼠建立了猪囊虫病的实验动物模型，应用该模型进行上述疫苗的免疫预防试验，免疫1次和2次的免疫保护率分别为96．9％和98．4％。本动物的免疫预防试验显示，疫苗安全性好，免疫保护率达92．2％，且免疫组发现的囊虫多数已死亡。在流行区进行了田间和区域试验。免疫猪未有不良反应，囊虫感染率分别由20％降为1．1％和5．4％降为0．21％。用该疫苗对人工感染的囊虫病猪进行免疫治疗，发现在感染早期的治疗效果较好。免疫动物的体液免疫和细胞免疫的检测结果显示，该疫苗刺激机体产生抗体的时间早、持续时间长、效价高；可显著提高淋巴细胞转化率及E－RFC和Ea-RFC细胞、ANAE^ 细胞和粗粒型ANAE^ 细胞、抑制／杀伤性T细胞亚群的数量。以上结果表明，用大肠杆菌表达的重组抗原制备的猪囊虫病基因工程疫苗安全、高效，且成本低廉，可规模化生产，有成为预防猪囊虫病的一种新型生物制剂。     

以包涵体形式表达的猪带绦虫六钩蚴重组抗原的复性与纯化

重组蛋白的复性是基因工程下游研究的难题和重点。本文应用夹心 ELISA 测免疫活性及变性与非变性 SDS-PAGE 测重组抗原单体和非单体的方法来评价不同复性条件.透析法复性,透析液为含2mg·kg~(-1)尿素、80μmol/PEG4000,0.1/0.1mmol·L~(-1)GSH/GSSG 的 pH 8.0的0.05mg·kg~(-1)PB,以静置缓慢透析为佳,上述条件任意缺一或快速透析,免疫活性下降,二聚体或多聚体明显增加;稀释法复性,复性液为上     

福建省平潭岛春季恙虫病流行病学调查研究

针对近年来平潭岛出现春季恙虫病的病例发生及流行,在春季对该地进行全面流行病学调查与研究。包括自然地理和医学地理学调查;间接免疫荧光法(IFA)调查当地人群中血清抗体水平及回顾性询问调查患病史;捕鼠及采集体表恙螨,分类、鉴定、统计,确定宿主、媒介的优势种群,并用PCR法检测恙虫病东方体(Ot)DNA;将病人血标本,鼠脏器标本和地里纤恙螨标本接种小鼠进行Ot分离,并从分子水平上确定分离株Ot型别。结果确定该地区为南亚热带丘陵岛屿型疫源地,IFA法检测平潭岛正常人群血清标本141份,结果抗Ot阳性46份,阳性率为32．6％。询问调查当地居民367人,63人有患病史,患病率为17．2%。主要宿主动物为黄毛鼠,主要媒介为地里纤恙螨。啮齿动物携螨率为45．1%,PCR检测40只野鼠和恙螨5组(20只／组),其中4只鼠恙虫病Ot阳性,阳性率为10％,2组螨体Ot阳性,阳性率为40％(2／5);从病人、宿主及媒介3种标本均分离到恙虫病Ot,序列测定结果表明此3株Ot之间5．6万基因片段同源性大于99％,与Karp型同源性为93．8％。从而确定平潭岛春季恙虫病疫源地的存在,为今后有针对性的防制提供依据。     

猪囊虫病疫苗用SOA工程菌的培养与发酵工艺

以摇床振荡培养猪囊虫病疫苗用ＳＯＡ工程菌,确定了其最佳培养条件：培养基为含０．２％葡萄糖的ＬＢ磷酸盐复合培养基（ｐＨ７．４）,诱导剂为１％乳糖,培养温度为３７℃。以此为基础进行工艺放大,研究了ＳＯＡ工程菌在７０Ｌ国产发酵罐中的发酵培养工艺,确定了接种量、ｐＨ、气压、溶解氧、温度等参数。试验结果显示,种子罐细菌量为ＯＤ６００＝４．０时,接种到发酵罐的菌体收获量最高;罐体气压在０．０５～０．２５ＭＰａ之间变动对工程菌产量、活菌数及表达量等均无明显影响;整个发酵过程中,发酵条件比较稳定,ｐＨ为７．４～７．０,溶解氧保持在１００以上,温度３６～３８℃,发酵时间８～１０ｈ。发酵结束,发酵液ＯＤ６００高达１１．２,活菌数为１０３亿／ｍＬ,表达量为１６．２％,重组质粒稳定。