利用RNAi技术靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制

构建了针对新城疫病毒NDV NA-1株P基因的RNAi质粒;转染质粒36 h后接种NDV,通过对病毒滴度测定、实时荧光定量PCR和细胞病变结果分析,表明其能抑制NDV在CEF中的复制和增殖.本试验为进一步研究NDV复制机理和抗病毒治疗提供了技术基础.     

鹅源副黏病毒NA-1株全长cDNA克隆的构建及鉴定

应用cRACE法扩增鹅源副黏病毒NA-1株cDNA 5'末端.参照Peter等的方法设计引物,扩增鹅源副黏病毒NA-1株cDNA的3'末端.根据GenBank上发表的鹅源副黏病毒序列设计6对引物,应用RT-PCR方法分6段扩增此病毒结构基因序列,并将其连接完成后与连接有鹅源副黏病毒NA-1株末端序列的转录载体连接,构建得到全长cDNA克隆.鹅源副黏病毒NA-1株全长cDNA克隆成功构建,为下一步病毒的拯救奠定坚实的基础.     

猪戊型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中注册的AJ272108等序列,参考有关文献,利用引物设计相关软件在HEV ORF2片段的保守区设计并合成1对引物及探针,采用TaqMan探针建立了荧光定量PCR法。以鉴定正确的质粒为模板建立标准曲线,Ct值线性范围为14.89~27.02,相关系数为0.996。本试验建立的猪戊型肝炎病毒ORF2片段基因实时荧光定量PCR方法扩增效率高、线性范围广,为快速检测猪戊型肝炎病毒的绝对定量分析奠定了基础。     

猪源副黏病毒JL-1株全基因获得及遗传变异分析

利用本实验室分离保存的猪源副黏病毒JL-1株来提取病毒基因组RNA.参考GenBank发表的相关禽副粘病毒Ⅰ型(Avian paramyxovirus serotype 1,APMV-1)基因组序列,设计了8对特异性引物,RT-PCR法分别特异性的扩增出病毒各基因片段,并将各目的基因片段回收纯化,将纯化后的PCR产物进行测序.测定结果得到NP、P、M、F、HN、La、Lb、Lc 8段基因序列,利用DNAMAN软件进行拼接得到基因组全长cDNA序列(GenBank登录号:EU546165).序列分析结果表明,PPMV JL-1株与各地代表株核苷酸同源性87.85%～99.78%,与鹅源新城疫(GPMV)ZJ-1、NA-1株核苷酸同源性分别为83.31%、83.46%,同时根据各毒株F基因开放阅读框前389个核苷酸序列绘制出系统发育进化树,结果表明PPMV JL-1株与LaSota同属于基因Ⅱ型,不同于基因Ⅶ型的ZJ-1和NA-1株的鹅源毒株.     

应用巢式PCR检测猪戊型肝炎病毒核酸及其序列分析

根据GenBank注册的AJ272108等序列,利用Oligo6应用软件设计内外2对引物,采用RT-PCR技术时本实验室分离的猪戊型肝炎病毒进行探索性扩增,并对测定的序列进行分析,结果用套式引物扩增出了目的条带,序列·分析表明该序列属于基因Ⅳ型,并与其核苷酸同源性在85.6%～94.8%之间,氨基酸同源性在99.1%～100%之间.而与基因Ⅲ型核苷酸同源性最低,与基因Ⅱ型氨基酸同源性最低.     

间接ELISA筛选鹅源副粘病毒病单克隆抗体方法的建立

将鹅源副粘病毒NA-1株接种SPF鸡胚进行病毒增殖,用蔗糖密度梯度离心对病毒进行纯化.用提纯的鹅源副粘病毒作为抗原包被ELISA板,通过反应条件的筛选,建立检测鹅源副粘病毒病单克隆抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原最佳包被质量浓度为5 mg·L-1,血清最适稀释度1∶80,其作用时间为60 min,羊抗鼠酶标二抗的最适质量浓度为1∶6 400,最适作用时间为60 min,37℃显色15 min.不与小鹅瘟等3种疫病阳性血清发生反应.对282孔杂交瘤细胞液进行检测,阳性检出率为12.77%,高于血凝抑制试验的阳性检出率(10.28%),符合率为91%.