tPA乳腺组织特异性表达载体构建及转基因小鼠建立

以pKB、pcDNA3和pCPA为原始质粒，构建BLG启动子调控的组织型纤溶酶原激活剂（tPA）乳腺组织特异性表达载体pBTA。以SalⅠ酶切质粒pBTA，回收5.45kb基因片段BLG－tPA-bGHpolyA，通过显微注射，导入昆明小鼠受精卵的雄原核内。共注1365枚，将存活的1053枚移植的50只同期发情假孕母鼠的输卵管内，怀孕24只，共产仔79只，上述仔鼠通过PCR检测，结果19只阳性。Southern blotting检测上述19份PCR阳性小鼠基因组，其中4只为整合阳性，说明已获得了乳球蛋白启动子调控下的tPA转基因小鼠，为tPA在小鼠体内表达研究提供了必要条件。     

草铵膦对斑马鱼胚胎及仔鱼的毒性研究

草铵膦(glufosinate-ammonium,GLA)是一种广谱触杀型非选择性除草剂,随着在生产中应用的不断增加,其生物安全性也越来越受到人们的重视。试验以斑马鱼Danio rerio胚胎为动物模型,用不同剂量的草铵膦染毒受精后2h的斑马鱼胚胎,观察其死亡率和形态学变化,并应用原位杂交和QRT-PCR技术检测了Vasa基因表达情况,以分析草铵膦的毒性作用。结果表明:1.6μg/L的草铵膦对斑马鱼胚胎有显著致死作用、1.3μg/L的草铵膦有显著致畸作用,其中畸形表现为尾部弯曲和阻碍黑色素沉着。原位杂交结果显示:1.3μg/L的草铵膦可引起Vasa表达的部分缺失,QRT-PCR定量分析发现,草铵膦可引起斑马鱼胚胎Vasa基因表达水平下调3.8倍。表明草铵膦对斑马鱼胚胎有较强的致死毒性、致畸作用和潜在的生殖毒性。     

ucp2基因敲除斑马鱼的模型建立 及其铝暴露神经毒性相关研究

利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼ucp2基因,研究ucp2基因在铝致斑马鱼痴呆中的作用.针对斑马鱼ucp2基因设计并制备gRNA,通过显微注射技术将gRNA与Cas9-mRNA混合注入斑马鱼单细胞胚胎中,利用酶切和基因测序筛选出发生突变的F0代斑马鱼,与野生型斑马鱼杂交得到F1代斑马鱼杂合子,分析其突变类型,将突变类型一致的斑马鱼杂合子杂交,获得F2代.在酸性AlCl3中暴露F2代斑马鱼胚胎,暴露组的斑马鱼个体行为出现异常,移动距离、移动速度和移动频率皆显著下降(P＜0.01),体内活性氧(ROS)水平显著升高(P＜0.01);其中KO+AlC13组导致的异常更为明显,psen1、psen2、tnf-α和il-1 β mRNA转录水平显著上调(P＜0.01).ucp2在铝致斑马鱼痴呆中起到重要作用,可能是其关键的治疗预防靶点.     

重组逆转录病毒载体系统的建立及其感染滴度的研究

选择新霉素磷酸转移酶II（Neo^R)做为标记基因,将重组逆转录病毒载体经包装细胞馐后得到的重组病毒浓缩后,应用该重组逆转录病毒载体系统体外感染靶细胞NIH3T3以测定其滴度,其滴度可达到10^6,具有理想的感染靶细胞的能力。     

鸡卵清蛋白基因5′调控序列表达载体的构建及其在鸡原代输卵管上皮细胞及鸡成纤维细胞的表达

将氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因与鸡卵清蛋白基因上游调控序列融合，构建了pCAT-3-OVP(鸡卵清蛋白基因5′调控序列）表达载体。将构建的载体与脂质体混合后制备转染液，转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞进行瞬时表达。结果表明，在鸡原代输卵管上皮细胞，转染后48h表达量最高，为0．67μg/L;而在鸡成纤维细胞，不论有无类固醇激素存在，均不表达。结果提示，在输卵管细胞中存在细胞特异性转录因子。