改良背主动脉注射法对鸡胚发育与转基因表达效率的影响

背主动脉注射是生产转基因鸡的经典方法,该方法不需换壳培养,但壳内注射技术难度大,并且无法实时观察后期胚胎发育情况.本实验对背主动脉注射法进行了改进,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)壳外注射至150枚HH 14～16期(Hamburger-Hamilton...     

PhiC31整合酶电穿孔鸡成纤维细胞诱发位点特异性基因盒交换

旨在验证直接电穿孔重组蛋白PhiC31能否在鸡DF-1细胞中诱导PhiC31介导的基因盒交换。本研究通过原核表达和经亲和层析纯化获得SUMO-His-PhiC31融合蛋白，利用SUMO酶切除SUMO-His标签，获得天然的PhiC31蛋白。这两种蛋白先与pBCPB+质粒在试管内共孵育进行分子重组反应。之后，先将带有attP^TT-DsRed2-attP^CT片段的“着陆点”(landing pad, LP)质粒通过电穿孔导入DF-1细胞，然后进行第二次电穿孔，将带有attB^TT-EGFP-HiBiT-attB^CT的donor质粒连同PhiC31蛋白导入上述DF-1细胞，验证DsRed2-EGFP基因盒交换事件发生。结果显示，成功构建了原核表达载体pET-28a-SUMO-PhiC31,经IPTG诱导，该重组质粒在大肠杆菌中以可溶性方式表达SUMO-His-PhiC31融合蛋白，经亲和层析纯化，SUMO-His-PhiC31蛋白的产量达12 mg·L^-1;该融合蛋白和切除SUMO-H...