毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株微线蛋白-2基因在大肠杆菌的表达

根据克隆的毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株微线蛋白-2基因(EnMIC-2(Gd))的cDNA序列设计特异性引物，用PCR方法扩增其阅读框架(ORF)后，克隆至质粒表达载体pET-32a( )，成功构建了重组表达质粒pET-32a( )-EnMIC-2。用CaCl2法将其转化至宿主细菌E.cliBL21(DE3)，并用IPTG成功诱导了EnMIC-2重组抗原在大肠杆菌表达。表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的10．8％，其相对分子质量约为55000。重组蛋白经SDS-AGE分析后，用E．necatrix(广东株)感染鸡的高免血清进行Western Blotting分析，结果为阳性。     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。     

猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法的研究

以猪附红细胞体和多种血营养菌16S rRNA基因的保守区设计合成引物HM-f/HM-r,在反向引物的5′端用生物素标记,以猪附红细胞体广东株16S rRNA基因的可变区序列设计种特异性寡核苷酸探针,探针的5′端用地高辛标记,成功地建立了猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法。通过测定不同浓度PCR产物对应的微孔板杂交-酶反应显色OD值,用SPSS统计软件进行回归分析,得到回归方程为y=2.1012-0.4492×logx,其相关系数R为0.977,显示对未知样品可进行定量检测。该方法与猪的多种细菌性病原、猫血巴尔通氏体CA株和E.wenyonii无交叉反应,其敏感性比常规PCR琼脂糖电泳检测提高了近100倍。用建立的方法对38份临床样品进行检测,结果有12份检测结果为阳性。     

传染性腔上囊炎疫苗免疫鸡TLR7基因表达的动态变化

给11日龄雏鸡分别口服接种鸡传染性腔上囊炎（IBD）弱毒疫苗（法贝灵，IBD-Blen）1和3头份后，于不同时间采集脾和腔上囊组织，分离纯化淋巴细胞，常规方法抽提总RNA，以鸡伊actin基因为内参，采用半定量RT—PCR法检测两种组织中鸡Toll样受体7（ChTLR7）基因的表达动态。结果显示，接种IBD弱毒疫苗前，试验鸡脾和腔上囊组织中均有ChTLR7的微量表达，疫苗接种后第7h，脾中ChTLR7 mRNA的表达开始显著上调，至接种后第12h达峰值，此后迅速下降，至第130h时降至疫苗接种前的水平；而腔上囊组织中ChTLR7 mRNA的表达自接种后第12h开始增加，第24h时达峰值，随后迅速下降，约72h后恢复至疫苗接种前水平。表明ChTLR7可能参与了IBDV感染早期的天然免疫反应过程。     

青铜峡市设施农业的发展与思考

设施农业作为高效农业的一个重要载体，是先进农业生产力的重要标志，是建设现代农业、繁荣农村经济、增加农民收入的有效途径。     

堆型艾美耳球虫子孢子表面抗原基因cSZ1的克隆及序列分析

根据已报道的堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计特异性引物,以孢子化12h的E.acervulina广东株卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法成功克隆了其子孢子表面抗原基因cSZ1(cSZ1(Gd))的cDNA。所克隆cSZ1(Gd)的cDNA全长940bp,其中第3～512位是其阅读框架,共编码170个氨基酸,两端为非编码区。与已报道的cSZ1基因的cDNA序列相比,cSZ1(Gd)有4个位置的核苷酸发生了变异,即原序列中第294、443、569、586位的G、G、G、A在cSZ1(Gd)分别为A、A、A、G,二者核苷酸序列的同源性为99.57％(936/940),其中阅读框架的核苷酸同源性为99.61%(508/510)。比较根据核苷酸序列推导的氨基酸序列,第294位的变异导致了所编码氨基酸由缬氨酸(V)变为异亮氨酸(Ⅰ),而第443位的变异则为无义突变,氨基酸序列的同源性为99.41％(169/170)。     

顶复门原虫电子转移链代谢及Ⅱ型NADH脱氢酶研究进展

顶复门原虫是包括刚地弓形虫、疟原虫及球虫等在内的一大类寄生性原虫的总称,可引起重要的人畜寄生虫病.抗顶复门原虫药物的长期使用,甚至是滥用,使得这类寄生虫对现有药物产生了明显的抗药性,急需开发新型药物.Ⅱ型NAD(P)H脱氢酶是电子转移链途径中的关键酶,由于其仅存在于某些植物、细菌、真菌和寄生原虫等一些低等生物体内,而在高等动物体内缺失,是研发新型抗感染性药物的重要靶标.笔者主要针对顶复门原虫线粒体电子转移链代谢途径以及Ⅱ型NAD(P)H脱氢酶的研究概况进行综述.     

鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用

本研究从鸭疫里默氏菌提取基因组DNA,采用细菌16S rRNA基因的通用引物,用PCR方法成功扩增出鸭疫里默氏菌的部分16S rRNA基因,克隆及测序结果表明其全长1512bp,G＋C含量为51％,该序列已登人GenBank,登录号为DQ078779。同时利用生物软件对GenBank收录的鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的16S rRNA基因序列进行分析后,设计了鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的种特异性引物,分别能从各自的16S rRNA基因中扩增出长度为342和718bp的DNA片段。并据此建立了一种能快速准确鉴别诊断鸭疫里默氏菌和大肠杆菌病的双重PCR方法,该方法能从肝脏组织悬液煮沸后的上清、细菌培养物或提取的细菌基因组DNA中快速扩增出相应的片段,进行鉴别诊断。     

rChlFN-γ对E.tenella卵囊免疫雏鸡肠道分泌型IgA+细胞数量的影响

本研究初步探讨了重组鸡γ干扰素(rChIFN-γ)对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)卵囊免疫接种鸡肠道粘膜slgA+细胞数量的影响.分别给7和14日龄雏鸡予以E.tenella孢子化卵囊免疫接种并同时肌注5 000 urChlFN-γ后,于21日龄用同源E.tcnella攻虫.免疫组化检测结果表明rChIFN-γ加强免疫组在21日龄时十二指肠、空肠、盲肠和回肠的绒毛sIgA+细胞数量均高于免疫对照组,在28日龄时,均呈现显著性差异(α=0.05).结果表明rChIFN-γ可提高球虫卵囊免疫雏鸡肠道内的sIgA+细胞数量,增强粘膜免疫水平,具有明显的抗球虫免疫增强效果.     

猪瘟病毒结构蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及评价

通过研究猪瘟(CSF)疫苗免疫猪抗结构蛋白E2、E0和C抗体的产生规律,为临床制定合理的CSF疫苗免疫程序提供参考。利用间接ELISA方法检测CSF疫苗免疫猪过程中,抗E2抗原血清抗体的产生特征;分别以重组猪瘟病毒(CSFV)结构蛋白E0和C为抗原,建立检测血清抗体的间接ELISA方法,评价其敏感性和特异性,并检测疫苗免疫过程中抗E0和C蛋白抗体的消长规律。结果显示:CSFV-E0和CSFV-C间接ELISA抗体检测方法的抗原最佳包被质量浓度分别为2.09和1.59μg/mL,待检血清样本最适稀释度分别为1∶60和1∶80,酶标二抗稀释度分别为1∶100和1∶350,2种ELISA方法与常见猪病原的阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性。CSF疫苗免疫后第7天即可检测到抗E2、E0和C蛋白的抗体,其中抗E2和E0的抗体在免疫后第21天达到最高水平,E2抗体滴度先上升后下降,E0抗体在免疫后第21天开始下降并最终趋于稳定;C蛋白抗体在免疫后第7天出现,随后开始下降,在第28天转为阴性。结果表明,利用重组抗原建立的CSFV血清抗体ELISA检测方法,可以用于评价CSF疫苗免疫后血清中针对3种结构蛋白的抗体消长特点,从而为临床猪瘟疫苗免疫程序的制定提供参考。