猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R²值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%～0.43%,组间变异系数为0.67%～0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。     

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示：VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。     

抗猪PABPC1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

细胞质聚腺苷酸结合蛋白1(PABPC1)是一种mRNA poly A结合蛋白,在维持mRNA稳定和蛋白翻译方面起着重要作用。本研究中将猪源PABPC1基因克隆并插入原核表达载体pCold-Ⅰ中,构建重组表达质粒pCold-pPABPC1。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并经过IPTG诱导表达重组猪PABPC1蛋白。然后,用纯化的rpPABPC1蛋白免疫BALB/c小鼠以制备PABPC1的单克隆抗体。Western blot结果表明,PABPC1单克隆抗体与PK1细胞和HEK293T细胞中的PABPC1蛋白发生了特异性反应。猪PABPC1特异性单克隆抗体为进一步研究PABPC1的功能提供了有价值的工具。     

猪源IRAV的克隆、表达及单克隆抗体的制备（英文）

干扰素调节的抗病毒基因(IRAV)是近年来被发现的一种具有抗病毒活性的新型干扰素刺激基因,其对登革热病毒的增殖具有良好的抑制作用,但目前鲜有猪源IRAV基因的研究。本研究,从PK-15细胞中克隆了IRAV全长的cDNA。猪源IRAV cDNA全长为1241 bp,其中包含858 bp的开放阅读框,编码一个大小为285个氨基酸的多肽,定位于细胞质。将猪源IRAV蛋白在BL21(DE3)中诱导表达,经纯化后免疫雌性BALB/c小鼠,最终获得5株分泌猪源IRAV单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞,分别命名为2B10、2G12、2H1、5A8和2C5。将获得的分泌性抗IRAV单克隆抗体经Western blot和间接免疫荧光试验分析后,确定该抗体可以与PK-15细胞中过表达的猪源IRAV发生特异性反应。本研究成功制备针对猪源IRAV的单克隆抗体,为后续深入研究猪源IRAV的功能奠定了基础。