绵羊肺炎支原体环介导等温扩增联合横向流动 试纸条可视化检测方法的建立

为建立绵羊肺炎支原体快速检测方法,用环介导等温扩增(LAMP)技术进行核酸扩增,通过横向流动试纸条(LFD)实现可视化检测。针对绵羊肺炎支原体HSP 70基因设计一套特异性引物,其中HSP70FIP由生物素标记进行LAMP扩增反应,产物与生物素标记的探针杂交后,在LFD上完成检测,建立了绵羊肺炎支原体LAMP-LFD快速检测方法,并对其特异性、敏感性及临床应用进行检测。结果表明,LAMP在62℃反应70min,即可特异性的检测绵羊肺炎支原体的存在,最低检测线为1.0×102 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的100倍,且对已知感染绵羊肺炎支原体的羊病变肺组织临床样品的检出率为100%。建立的LAMP-LFD检测绵羊肺炎支原体的方法特异性强、灵敏度高并且操作简便,为羊感染绵羊肺炎支原体的预防和诊断提供了新方法。     

基于绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白间接ELISA方法的建立

为解决绵羊肺炎支原体感染的预防问题,建立一种简单、快速、成本低的诊断方法,构建绵羊肺炎支原体EF-Tu基因原核表达载体,诱导纯化重组蛋白并用Western blot分析其反应原性,以重组蛋白为诊断抗原,建立绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法,评估其特异性和灵敏性。结果表明,构建的重组蛋白纯化后,经Western blot证实具有良好的反应原性;间接ELISA反应条件优化显示,抗原稀释度为0.25μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶50,最佳孵育时间为90 min,封闭液为50 g/L脱脂奶粉,二抗最佳稀释倍数为1∶8 000,最佳孵育时间为60 min,特异性与灵敏性良好;该方法与间接血凝法对100份血清进行检测,两者符合率为88.7%。说明试验建立的绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法可以推广使用。