水牛卵泡颗粒细胞对卵母细胞体外成熟的影响

为了系统研究颗粒细胞对水牛卵母细胞体外成熟的影响,使用颗粒细胞条件液处理或单层颗粒细胞和卵母细胞共培养的方法,探讨颗粒细胞共培养对水牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响.结果显示,添加颗粒细胞传代接种第2天收集的20％颗粒细胞条件液到水牛卵母细胞成熟液中能显著提高水牛卵母细胞体外成熟率和囊胚发育率(P＜0.05);然...     

聚乙二醇细胞融合技术在牛手工体细胞克隆中的应用初探

本研究分3个实验。实验1对比了不同浓度的离子霉素对牛去透明带卵母细胞孤雌激活的效果;实验2比较了手工半卵切割法去核与显微半卵切割法去核的效果;实验3对聚乙二醇（PEG）细胞融合技术在牛手工体细胞克隆的应用进行了初步探讨。结果表明,对于去透明带牛卵母细胞孤雌激活,离子霉素浓度为2．0μmol／L组的激活效果最好,其囊胚发育率（29．4％）极显著地高于浓度为5．0μmol／L的对照组和0．5μmol／L组（囊胚率分别为8．3％和9．4％,P〈0．01）;采用半卵切割法去核,手工切割的半卵存活率（85．6％）与显微操作（90．3％）差异不大,切割速率（约100枚卵／h）相仿。对双半卵与体细胞进行同步融合处理时,应用50％浓度的PEG融合率（39．3％）极显著好于45％、55％和60％的PEG（融合率分别为0％、16．2％和5．3％,P〈0．01）。     

大鼠OSP-1启动子克隆与表达检测

[目的]克隆大鼠卵巢特异性启动子（OSP-1）片段,并在细胞水平检测该启动子调控标记基因的组织特异性表达。[方法]参考已知大鼠OSP-1序列设计特异性引物,PcR扩增大鼠OSP-1启动子片段并与已公布的大鼠OSP—1序列进行比较。将OSP-1启动子定向克隆到去除CMV的pEGFP—N1载体,构建真核表达载体pOSP—1—EGFP．N1;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000介导下,分别转染水牛的颗粒细胞、乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞,并于转染后12,24和48h在荧光显微镜下观察EGFP表达情况。【结果lOSP—l启动子扩增片段长480bp,与已公布的大鼠OSP-1序列的相似性达96％;应用启动子预测软件对所得序列分析表明,该扩增片段含有类似于TA—TAbox和CAATbox的核心启动顺式元件,并含有多个C／EBPbeta转录因子的结合位点;在颗粒细胞转染后12h可观测到绿色荧光表达,转染后24h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大,48h荧光细胞数量骤减,且死细胞增多;在乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞均未检测到EGFP基因表达。[结论]大鼠OSP-1启动子控制下的EGFP基因可在水牛颗粒细胞中特异表达,为构建水牛卵巢特并性表达转基因载体奠定了基础。     

水牛小腔卵泡分离方法的初步研究

本研究比较了不同的分离方法和酶作用的不同时间,以及不同的卵巢表面状态等因素对水牛小腔卵泡分离效果的影响,以期建立有效的水牛小腔卵泡分离体系。结果发现,采用机械与酶结合的方法分离水牛小腔卵泡时,平均每个卵巢获得5.64个小腔卵泡,显著高于机械法分离平均每个卵巢获得的3.12个小腔卵泡数(P＜0.05);当胶原蛋白酶作用12或15 min,每个卵巢平均获得的小腔卵泡数均显著高于5和10 min处理组(P＜0.05),两组之间没有显著差异(P＞0.05),但当消化时间延长到20 min时,卵泡膜被酶消化而破裂,没法分离到小腔卵泡;从表面小于2 mm卵泡且无黄体的卵巢分离获得的小腔卵泡平均数显著高于表面无可见卵泡且有黄体的卵巢组的平均数(7.50和2.25,P＜0.05)。以上结果表明,选用表面无小于2 mm卵泡且无黄体的卵巢,采用机械与酶结合的方法,酶作用时间为12~15 min分离水牛的小腔卵泡,可获得的小腔卵泡数量最多。     

EGF和IGF-1对水牛卵母细胞体外成熟培养的影响

作者研究了在培养液中添加不同浓度的EGF、IGF-1以及EGF联合IGF-1对水牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明：①添加各种浓度的EGF都可以提高水牛卵母细胞的成熟率，其中50 ng/ml EGF有显著影响(P＜0.05)。②10、20 ng/ml的IGF 1对水牛卵母细胞体外成熟无显著影响(P＞0.05)； 30 ng/ml的IGF-1能显著提高水牛卵母细胞体外成熟率(P＜0.05)。③添加20 ng/ml EGF+30 ng/ml IGF-1组卵母细胞体外成熟率高于添加30 ng/ml的IGF-1组，显著高于添加20 ng/ml EGF组和对照组(P＜0.05)。可见，EGF和IGF-1对水牛卵母细胞体外成熟有协同作用。     

用单层分化法进行胚胎干细胞神经分化的研究

用单层分化法研究了 ES细胞从 0～ 316 h(第 14天 )的神经分化过程。无饲养层培养的 ES细胞在无血清的N2 B2 7培养基中开始神经分化。从 72 h开始 ,神经外胚层的特异性转录因子 Sox1表达 ,在克隆的边缘逐渐出现向外迁移的细胞 ,形状呈圆形或椭圆形 ,有 1～ 2个细胞突起。在 191h(第 8天 )之后 ,细胞可迁移至克隆边缘的 2 0 0 μm之外 ,这些有细长突起的细胞表达神经元特异性蛋白 Tau。以后 ,迁移细胞的突起开始交叠成网状。 316 h(第 14天 )时 ,细长的纤维可跨越在不同的克隆之间 ,长达上千微米。此时 ,免疫染色的结果表明 ,在克隆的中央有较多的圆形 Nestin阳性细胞 ,而克隆的边缘有大量的 β- tubulin 阳性细胞 ,它们交织成复杂的网状图像。阶段性表达基因的表达时序研究表明 ,ES细胞的特异性转录因子 Oct4开始减弱时 ,Sox1表达开始 ,此时细胞由全能状态进入早期神经分化状态 ;Tau的表达是 Sox1表达的下游事件。这一时序与胚胎发育中神经发生的时序相符。单层分化法能直观地展示 ES细胞的神经分化过程 ,可作为研究细胞分化、胚胎发育及药物筛选的体外模型     

不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对水牛胎儿成纤维细胞生长及其组蛋白乙酰化修饰的影响

研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对水牛胎儿成纤维细胞（BFF）生长特性、细胞毒性及其组蛋白H3K18乙酰化修饰的影响,为今后研究供体细胞的重编程及提高水牛核移植效率提供一定的理论依据。试验采用不同浓度（0、250、500、750 nmol/L）的Scriptaid分别处理BFF后观察细胞的生长形态,然后利用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,同时通过细胞免疫组化技术分析细胞组蛋白H3K18乙酰化的表达情况。结果发现,BFF经不同浓度的Scriptaid处理后,细胞形态没有显著变化,为长梭形、立体感较强,生长曲线与对照组相似,均呈“S”型分布,且各处理组细胞的存活率与对照组之间差异不显著（P＞0.05）;此外,Scriptaid处理组的细胞组蛋白H3K18乙酰化的相对荧光强度显著高于对照组（P＜0.05）,其中500和750 nmol/L 2个处理组细胞组蛋白乙酰化水平显著高于250 nmol/L处理组（P＜0.05）,而500和750 nmol/L 2个处理组之间差异不显著（P＞0.05）。可见,适合浓度的Scriptaid对BFF细胞形态和存活率影响不大,且能显著提高BFF的组蛋白乙酰化水平。     

GMP玻璃化冷冻对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻损伤和体外发育能力的影响

将体外成熟(IVM)24h的水牛卵母细胞随机分成对照组、冷冻剂毒性试验组、GMP玻璃化冷冻组,研究玻璃微细管法(GMP)冷冻对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻损伤和体外受精后发育能力的影响。结果表明:冷冻剂毒性试验组的存活率显著高于GMP玻璃化冷冻组;在透明带消化时间上,冷冻剂毒性试验组和GMP玻璃化冷冻组显著高于对照组。在单精入卵率上,冷冻剂毒性试验组和GMP玻璃化冷冻组显著低于对照组;在无精子入卵率上,冷冻剂毒性试验组和GMP玻璃化冷冻组与对照组差异显著;而多精入卵率3组间差异不显著。卵母细胞冷冻后进行体外受精,3组之间的2-细胞率,8-细胞率和桑椹胚率差异均极显著。表明冷冻剂和GMP玻璃化冷冻均会引起水牛MⅡ期卵母细胞透明带硬化,降低精子穿透率和其体外受精的发育能力。     

山毛豆草粉颗粒料对肉兔的饲用价值评定

为探讨山毛豆(Tephrosia candida)草粉对肉兔的饲用价值,将60只新西兰青年肉兔分为5组,分别添加0％(对照),10％,20％,30％和40％的山毛豆草粉制成全价颗粒饲料,饲喂90 d后测定各组饲料的营养成分及肉兔采食量、日增重、料重比和屠宰性能.结果表明:山毛豆营养生长期粗蛋白含量为17.77％,肉兔对山毛豆中粗蛋白的消化率为78.09％,山毛豆的可消化总养分为56.18％.与对照组相比,添加20％草粉日增重达到20.80 g·d-1(P＜0.01);料重比为4.45∶ 1(P＜0.05)；屠宰率为57.78％(P＜0.01)；单位kg增重平均最低饲料成本差异显著(P＜0.05).因此,添加20％山毛豆草粉制成全价颗粒饲料可显著提高肉兔的生产性能和养殖效益.     

不同细胞因子对水牛原始生殖细胞传代培养的影响

为探讨不同细胞因子对水牛原始生殖细胞（PGCs）传代培养的影响，将PGCs分别采用A、B、C、D、E、F和G共7种培养基进行培养，即A组：基础液＋10ng／mL白血病抑制因子（LIF）＋10ng／mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；B组：基础液＋20ng／mL LIF＋20ng／mL bFGF；C组：基础液＋20ng／mL LIF＋10ng／mL bFGF；D组：基础液＋20ng／mL LIF；E组：基础液＋20ng／mL LIF＋20ng／mL bFGF＋20ng／mL干细胞因子（SCF）；F组：基础液＋20ng／mL LIF＋40ng／mL bFGF＋40ng／mL SCF；G组（对照组）：基础液。将机械法分离的PGCs小集落接种到水牛胎儿成纤维细胞（BEF）饲养层上进行传代培养。结果，原代时，A、B、C、D、E和F组的克隆数目都显著高于对照组（P％0．05），其中E和F组的克隆数目显著高于A组（P〈0．05），而与B、C、D组差异均不显著（P〉0．05）；1～8代时，B、C、D、E、F组的克隆数目显著高于A组（P〈0．05）；对照组传代数仅为2代，A组为5代，而B、C、D、E和F组均为8代以上。结果表明，在传代过程中，LIF起主要作用，20ng／mL的LIF浓度可以满足水牛PGCs传代培养的需要。