CDV、CPV和CPIV多重PCR检测方法的建立

为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740 bp)、CPV(419 bp)和CPIV(559 bp)的多重PCR方法.结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1 ng/μL.临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

15种鱼转铁蛋白cDNA序列保守性分析

运用计算机分析软件,对克隆的鲫鱼血清转铁蛋白cDNA序列与14种鱼进行了碱基组成、序列同源性和一级结构保守性分析。鱼类转铁蛋白cDNA序列一级结构中,根据序列保守性可以划分为从A至G的7个区域,分别命名为:受体结合区(1个)、铁离子结合区(2个)、次易变区(2个)和易变区(2个)。     

15种鱼转铁蛋白cDNA序列密码子使用比较分析

运用DNAman v4.0分析软件,对克隆的鲫鱼血清转铁蛋白cDNA序列与文献中的14种鱼转铁蛋白cDNA序列的同源性、密码子使用频率和密码子使用偏性进行分析,结果表明:鲤形目鱼类Tf的cDNA序列同源性在46%以上,而鲑形目鱼类Tf的cDNA序列同源性在34%-99%之间,变化较大。密码子使用频率越高或使用偏性越小,说明陔密码子编码的氨基酸对蛋白质空间结构的形成和基本生理功能的影响也越重要;在进化上分化时间越早的物种,密码子使用频率和使用偏性的差异较小,反之则较大;在同源性方面,在进化上比较接近的物种,基因的密码子使用频率和使用偏性指标比较接近或基本相同。根据对15种鱼Tf的cDNA序列同源性和密码子分析,推测Tf基因的进化顺序是:鲤形目、鳕形目、鲑形目和鲽形目。     

犬细小病毒CPV-QD12株的分离鉴定与序列分析

本试验成功分离了1株犬细小病毒,采用PCR、理化特性检验、HA及HI等方法对其进行了鉴定,并对其编码区全基因序列进行了分析。取临床患出血性肠炎幼犬粪便经无菌处理后同步接种F81猫肾细胞分离病毒,盲传至第4代开始出现典型的细胞病变。该病毒可凝集猪的红细胞,血凝效价为28,可被犬细小病毒单克隆抗体特异性中和而产生血凝抑制现象;病毒效价为105.5TCID50/m L;毒株对氯仿和胰酶不敏感,且耐酸耐热。经病毒理化特性试验及犬细小病毒单克隆抗体的血凝抑制鉴定其为犬细小病毒,通过PCR检测及编码区全基因的扩增、测序和序列比较,证实所分离毒株为CPV-2a亚型,并将其命名为CPV-QD12株,与2013年分离自中国江苏省的CPV-2a型犬细小毒株CPV-JS2及2011年分离自中国广西的CPV-2a型毒株CPV-JQ686671.1的编码区核苷酸相似性为99.6%,具有较近的亲缘关系。该研究可为诊断和防控犬细小病毒病提供参考。