鸡传染性法氏囊病病毒rVP2蛋白高效组装亚病毒颗粒的鉴定

为获得高纯度的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2蛋白自组装的亚病毒颗粒（subviral particles,SVPs）,并对重组VP2蛋白（rVP2）SVPs的组装效率和均一性进行评价,本试验利用大肠杆菌表达IBDV rVP2,通过SDS-PAGE和Western blotting对蛋白表达情况和免疫反应性进行鉴定,通过阴离子交换层析和切向流超滤浓缩系统纯化rVP2蛋白,并通过透射电镜（TEM）、高效液相尺寸排阻色谱（HPSEC）、蔗糖密度梯度离心及粒径和表面电位（Zeta potential）等多种检测技术对单个SVP组装形态和整体组装情况进行分析检测,初步建立了IBDV rVP2 SVPs组装效率的系统性检测方法。结果显示,在大肠杆菌中实现IBDV rVP2的大部分可溶性表达,且能与鸡IBDV阳性血清有明显的免疫反应性,纯化后rVP2纯度提高66.9倍,回收率达到93.3%。TEM观察rVP2自组装成直径约25 nm的SVPs,视野内SVPs大小均一,均匀分散。HPSEC检测结果显示,rVP2 SVPs的分子质量约为2 482 ku,与20个VP2三聚体形成的T=1二十面体SVPs分子质量一致。蔗糖密度梯度离心检测结果显示,rVP2 SVPs体积分布均一,组装效率高。粒径和Zeta电位检测结果表明,rVP2 SVPs颗粒分散度较好、体系稳定,有利于rVP2 SVPs的长期保存。本试验通过多种检测技术对rVP2 SVPs的组装情况进行检测分析,实现了rVP2 SVPs的高效组装,为IBDV SVPs疫苗的质量控制提供了有力支撑。     

禽腺病毒(C种,4型)精制卵黄抗体研制及免疫效果评价

为了评价以禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白为免疫原制备精制卵黄抗体的免疫效果,本研究使用重组大肠杆菌BL21(DE3)-Fiber-2株诱导表达禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白,蛋白纯化后制备免疫原,免疫产蛋鸡收获高免蛋,经提纯获得的精制卵黄抗体AGP效价达1∶8;将精制卵黄抗体注射SPF鸡进行免疫效果...     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的表达与单克隆抗体的制备

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV) DP96R蛋白单克隆抗体,根据大肠杆菌密码子优化后的DP96R基因序列设计引物,PCR扩增后连接表达载体pET28a-SUMO构建pET-SUMO-DP96R原核表达质粒,将该质粒转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导,获得可溶性的DP96R蛋白.通过Western blot鉴定该蛋白...     

山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组序列分析

为了解目前我国猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株基因组特征，本实验室于2020年从山东某养殖集团不同场区采集7份疑似感染PRRSV的组织样品，进行RT-PCR检测，将阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAM)分离病毒，利用间接免疫荧光试验(IFA)对分离病毒进行鉴定，经PCR对分离株全基因组序列分段扩增，采用生物信息学软件对分离株的ORF5基因及全基因组序列的同源性、NSP2氨基酸序列缺失特征和ORF5氨基酸变异位点及糖基化位点、ORF5基因与全因因组遗传演化关系分析以及全基因组的重组分析。结果显示：7份组织样品均呈PRRSV阳性，其中有6份阳性样品接种猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)后产生细胞病变，且通过荧光显微镜可观察到特异性绿色荧光，表明分离到6株PRRSV；对6株PRRSV的全基因组序列扩增、测序、拼接，通过全基因组序列同源性对比发现6株PRRSV全基因序列之间的同源性约99.4%～100%，表明6株PRRSV是同一来源，选择其中1株(SDlz0720株)进行后续分析。序列分析结果显示：SDlz0720株NSP2氨基酸序列均具有“111+1+19aa”的缺失特征，与NADC30-...     

我国近5年类NADC30 PRRSV毒株序列的重组及限制性片段长度多态性分析

为了解我国类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株的流行和遗传变异情况，本研究利用生物信息学软件对本实验室2016-2020年获得的64条类NADC30毒株序列进行分析。Nsp2氨基酸序列比对结果表明，64株毒株均表现出与NADC30毒株一致的131个不连续的氨基酸缺失。其中，9株在Nsp2区域除该缺失特征外，另含有额外的氨基酸缺失。基于全基因组遗传演化分析结果表明，61株分布在Sublineage 1.8(类NADC30),3株分布在Lineage 8(HP-PRRSV)。而基于ORF5序列的遗传演化分析结果则更分散，56株分布在SubLineage 1.8,5株分布在Lineage 8,2株分布在Lineage 5(类VR2332),1株分布在Sublineage 1.5(类NADC34)。经RFP4和Simplot生物学软件进行重组分析结果表明，64株毒株中可能有44株为重组毒株，共表现出5种重组模式，其中以NADC30提供骨架，HP-PRRSV提供重组片段为主要模式。重组热点分布在非结构蛋白区域5′UTR～1 500 nt(Nsp1)、5 374～8 177 nt...