新型鸭呼肠孤病毒DH13株结构蛋白σB的原核表达及免疫原性分析

本研究旨在利用原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒（NDRV） DH13株重组σB蛋白,并检测其免疫原性,为NDRV基因工程疫苗研制等提供物质材料。采用RT-PCR方法扩增获得NDRV σB基因,构建原核表达重组质粒pET-30a-σB和pET-32a-σB,将2个重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。纯化无His的σB蛋白,并以此蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,制备兔源多克隆抗体。利用Ni²⁺柱亲和层析法纯化含His的σB蛋白,以此蛋白作为检测原,通过间接ELISA方法测定兔源多克隆抗体效价;Western blotting鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性识别能力。结果显示,PCR扩增获得大小约为1 100 bp的σB基因片段。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了2种重组σB蛋白,大小分别约为41和46 ku,均以包涵体形式存在。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶204 800,能特异性地识别原核表达的重组蛋白,表明重组无His的σB蛋白具有良好的免疫原性。Western blotting特异性鉴定结果显示,含His的σB蛋白和无His的σB蛋白均与制备的兔源多克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达得到的重组σB蛋白具备良好的反应原性。本试验利用原核表达系统成功地表达出了重组σB蛋白,并证实了重组NDRV σB蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该结果将有助于后续对NDRV σB蛋白生物学功能的鉴定、NDRV诊断用抗原的制备及NDRV新型疫苗的研制。     

2株3型鸭甲肝病毒广东分离株的鉴定与遗传进化分析

为了解广东省某两个养殖场发生的疑似鸭病毒性肝炎病例感染的病原体,试验对两个养殖场送检的2份病料采用RT-PCR、病毒分离和序列分析等方法对病毒进行鉴定;病料处理后接种10日龄SPF鸭胚、9日龄SPF鸡胚尿囊腔进行病毒分离,并扩增病毒全基因组及VP1基因,利用DNAStar 7.0和MEGAⅩ对分离株与GenBank中公布的相关病毒株序列进行同源性比对、氨基酸序列比对并构建系统进化树。结果表明：从病料中成功分离并鉴定2株3型鸭甲肝病毒(DHAV-3),分别命名为GD18株和GD21株;2份病料攻毒均未引起鸡胚的死亡与明显病变,但引起了鸭胚的发育不良,且GD21株可引起鸭胚死亡,死亡胚体出现全身性出血、充血等特征性病变;分离的2株DHAV-3均属于GⅠ基因型,且与之前在广东省流行的FS株、GD株和C-GY株等毒株亲缘关系较远,而与广东省外流行毒株SD株、JS株、CH株和EY株等亲缘关系较近。与参考株氨基酸序列比对,GD18株在第49位和第67位出现2个新的突变位点,而GD21株没有出现新的突变位点。说明在广东省内鸭群中可能存在由于引种或贸易过程而引入的DHAV-3新毒株的流行。     

4株Ⅰ亚群禽腺病毒分离株对SPF雏鸡的致病性研究

【目的】探究Ⅰ亚群禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)分离株GDDL-4(FAdV-4)、GDB3-8a(FAdV-8a)、GDT08-8b(FAdV-8b)、GDWYT-11(FAdV-11)对SPF雏鸡的致病性,进而制定更加有效的防控措施。【方法】设立4个攻毒组(GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11)及对照组,攻毒组选择腿部肌内注射接种0.2 mL 10⁵ TCID₅₀病毒液,对照组接种等体积PBS。接种后观察SPF雏鸡的临床症状、剖检病变及组织病理学变化,同时检测其排毒量和病毒载量。【结果】所有攻毒组鸡均表现为精神沉郁、消瘦、扎堆等,病理剖检以严重心包积液-包涵体肝炎综合征病变为主,其中GDDL-4组症状最为严重,死亡率最高达85%,总体死亡率在0～85%之间。排毒分析结果发现,GDDL-4和GDB3-8a组出现高滴度排毒(≥10⁴拷贝/μL),GDT08-8b和GDWYT-11组仅能检测到低滴度(≤10³拷贝/μL)排毒。器官指数表明,除GDT0...     

禽呼肠孤病毒检测方法研究进展

禽呼肠孤病毒(avian reovirus, ARV)主要引起家禽病毒性关节炎和免疫抑制,进而导致继发感染。近年来,随着ARV及其变异毒株的出现,加之传统疫苗对变异株的保护力不足,且没有特效药物治疗,使我国禽养殖业面临ARV感染的巨大风险。目前禽养殖场主要通过严格的生产管理结合周期性检测对禽呼肠孤病毒病进行防控。因此,本文着重介绍并分析了国内外已报道的ARV检测方法,为ARV的监测及新型诊断技术的研发提供依据,同时也为疫病的防控提供参考。     

鸭干扰素刺激基因的克隆、表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因（interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5）并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5（登录号：KF956064）序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明：目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1：49 600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真核表达的鸭IFIT5蛋白。综上,成功克隆了鸭干扰素刺激基因IFIT5,制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体可用于鸭IFIT5蛋白的检测,可为鸭IFIT5蛋白的后续研究提供材料支撑。     

鸭坦布苏病毒SCCD2020株的分离鉴定及其E基因、NS1基因序列分析

为确诊四川某鸭场11日龄樱桃谷雏鸭死亡原因,本研究采集送检鸭只的肝、脾、脑组织,经研磨处理,利用BHK-21细胞及鸭胚成纤维细胞培养及RT-PCR鉴定,从送检的疑似鸭坦布苏病毒感染的病料中分离出一株鸭坦布苏病毒,将其命名为SCCD2020株.利用PCR方法对分离株E基因及NS1基因进行克隆,并对两基因序列进行分析,结果...     

水禽圆环病毒巢式PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种快速、灵敏、特异的水禽圆环病毒检测方法,试验根据GenBank中已公布的鸭圆环病毒(DuCV)和鹅圆环病毒(GoCV)的Rep基因序列设计3条特异性引物,对扩增条件进行优化,并检验优化后方法的特异性和灵敏性,最后用建立的水禽圆环病毒巢式PCR检测方法对40份疑似水禽圆环病毒感染的病料进行检测。结果表明：水禽圆环病毒巢式PCR方法可成功扩增出719 bp和543 bp的目的片段;优化后的一轮、二轮PCR中退火温度分别为50,56℃,引物加入量均为0.6μL,二轮PCR的模板稀释倍数为1×10³倍。优化后的方法对水禽圆环病毒的检测具有较好的特异性,与鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、H5N6亚型禽流感病毒(AIV)、H9N2 AIV、新城疫病毒(NDV)、鸭瘟病毒(DEV)、鹅细小病毒(GPV)及鹅星状病毒(GoAstV)均无交叉反应;该方法的最低检出限达4.04×10²拷贝/μL,分别是一轮、二轮PCR最低检出限的1×10⁴,1×10³     

Ⅰ群禽腺病毒多种血清型的Hexon、Fiber基因遗传进化分析

为了进一步丰富和完善广东地区禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)的分子流行病学,试验采用PCR及基因克隆测序技术对2014—2020年期间瑞普(天津)生物药业有限公司分离保存的9株Ⅰ群FAdV分离株进行分子生物学鉴定,并通过MEGA 5.1软件对各分离株的Hexon与Fiber进行遗传演化分析。结果表明：9株Ⅰ群FAdV分离株中有5株4型分离株,分别为GDDL-4、GDHQY-4、GDLHX-4、GDZMY-4、GDZYQ-4;2株8型分离株,分别为GDB3-8a和GDT08-8b; 2株11型分离株,分别为GDWYT-11和GDZWJ-11。分离株GDDL-4、GDHQY-4、GDLHX-4、GDZMY-4、GDZYQ-4与FAdV-4型国内参考株GDMZ(GenBank登录号MG856954.1)的同源性为99.9%～100%;分离株GDB3-8a、GDT08-8b与FAdV-8a英国参考株764(GenBank登录号KT862811.1)的同源性为97.1%～97.7%;分离株GDB3-8a、GDT08-8b与FAdV-8b日本参考株TR59(GenBank登录...     

新型鸭呼肠孤病毒DH13株σC蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在建立新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）σC蛋白的原核表达系统,制备σC蛋白的多克隆抗体,并评估所制备抗体的效价。通过RT-PCR方法扩增获得NDRV DH13株σC基因,连接至pET-30a（+）及pET-32a（+）载体中,构建原核表达质粒,并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导获得两种σC重组蛋白,经SDS-PAGE分析蛋白表达形式。利用切胶方法纯化不含His标签σC重组蛋白,利用Ni-NTA柱纯化含His标签σC重组蛋白。以纯化的无His标签蛋白为免疫原免疫兔子获得兔抗σC多克隆抗体,Western blotting分别使用抗His标签的单克隆抗体和NDRV-σC蛋白阳性血清两种一抗评估抗体的特异性,间接ELISA（iELISA）检测抗体滴度。SDS-PAGE结果显示获得34和37 ku两种重组蛋白,且均得到高效表达。Western blotting结果显示制备的多克隆抗体具有良好的特异性,所制备的抗体与σC蛋白亲和力较好。间接ELISA检测结果显示其效价达1：25 600。本试验成功构建σC蛋白的原核表达系统,制备的σC蛋白多克隆抗体为深入研究σC蛋白的生物学功能及开展NDRV基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒I177L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备抗非洲猪瘟病毒I177L蛋白的多克隆抗体,根据HLJ/2018株的I177L序列,设计引物,扩增带有His标签序列的I177L序列,并将其插入pMAL-c5x原核表达载体中,转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达和切胶纯化后,用Xa蛋白酶因子去除重组蛋白中的MBP标签。将处理后的I177L蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37℃、0.6 mmol/L IPTG条件下,诱导5 h后,重组MBP-I177L蛋白表达量最高,蛋白分子质量大小约为67 ku,与预期大小相符;重组蛋白以可溶性表达为主;多克隆抗体经Western blot、间接ELISA及IFA试验结果显示,抗体效价为1∶128 000,并且该抗体能特异性识别I177L蛋白。