大肠杆菌与粪肠球菌总蛋白不同提取方法的比较研究

为了探讨不同裂解方法对大肠杆菌及粪肠球菌蛋白质提取效果的影响,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对SDS裂解法、超声裂解法、试剂盒法提取细菌蛋白质效果进行了比较。结果表明:试剂盒法所提取的蛋白质丰度高于其他方法,且重复率高。说明加入含蛋白酶抑制剂混合物、溶菌酶、DNase酶的试剂盒裂解液有助于提高蛋白质的提取率。     

犬瘟热核衣壳蛋白原核表达及蛋白纯化

犬瘟热病毒(CDV)是一种单链RNA病毒,作为转录因子合成蛋白,共编码六个结构蛋白,其中核衣壳蛋白N(CDV-N)是保守性较强的免疫原性蛋白,在病毒感染时能引起强烈的抗体反应,对于CDV的诊断具有非常重要的价值。本研究的目的是构建CDV-N蛋白原核表达载体,利用原核表达技术纯化CDV-N蛋白。利用DNAStar软件预测CDV-N蛋白抗原表位,选择588bp截短体用于原核表达。设计引物,以本实验室保存的pMD18-T-CDV质粒为模板,PCR扩增CDV-N588片段,并将其TA克隆至pMD18-T载体。通过酶切鉴定和DNA测序,从pMD18-T-CDV-N588质粒上切取CDV-N588片段,再将其亚克隆至pET30a原核表达载体,构建重组质粒pET30a-CDV-N588。该重组质粒转化大肠杆菌BL21,ITPG在37℃诱导表达His-CDV-N588融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western Blotting加以验证。相同条件下大量增菌诱导,Ni-NTA琼脂糖珠在变性条件下分离纯化His-CDV-N588融合蛋白,再次用SDS-PAGE和Western Blotting进行验证。结果表明:pET30a-CDV-N在大肠杆菌BL21中得到高效表达;SDS-PAGE和Western Blotting检测证实,我们成功纯化了His-CDV-N588融合蛋白。本研究为制备CDV-N588蛋白单克隆抗体和研制胶体金诊断试纸条奠定了基础。