国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体

牛支原体(Mycoplasma boris)是引起犊牛肺炎、关节炎和成牛乳房炎的主要病原之一.本研究利用选择性培养基从2份患肺炎的犊牛肺脏病料中得到2株支原体,分别命名为Hubei-1和Hubei-2,并在固体培养基进行了3次克隆纯化.通过生化实验、特异性PCR鉴定和序列比较证明为牛支原体.其16S rRNA 核酸序列与牛支原体国际标准株PG45同源性为99.3%.以该培养物作为包被抗原的ELISA 检测方法对13份发病犊牛血清进行了检测,其中11份血清抗体OD值为阴性血清对照值的2倍以上.该结果首次证实,国内部分地区存在牛支原体的流行.     

猪肺炎支原体P102基因的突变

猪肺炎支原体是引起猪地方性喘气病的病原。人们预测猪肺炎支原体p102基因是猪肺炎支原体潜在的黏附因子。在p102基因中有七个密码子TGA，在猪支原体中编码色氨酸，而在原核和真核细胞中TGA为终止密码子。因此，为了将p102基因在原核与真核系统中表达，需将TGA突变成TGG。从猪肺炎支原体Yin-1株扩增p102基因（全长2700bp），将其分为A（1bp-936bp）、B（937bp-1665bp）、C（1666bp-2700bp）-S-段分别克隆进pMD-18T载体上，通过定点PCR方法把A段四个和C两段三个编码Trp的密码子TGA突变为TGG，每突变成功一个密码子后都要连接到pMD-18T载体上送测序。最后将突变成功三段基因按A＋B＋C的顺序相连亚克隆到pMD-18T载体上，得到质粒pMD-18T—P102。测序结果用MegAlign软件与国际标准菌株232进行比较，P102基因中七个TGA已经成功突变成TGG。P102基因定点突变的成功为其在原核和真核系统中的表达奠定了良好的基础，亦对猪肺炎支原体疫苗研制具有重要意义。     

猪肺炎支原体P52蛋白的原核表达及抗血清制备

为表达猪肺炎支原体(Mhp)P52蛋白及制备其血清,本实验利用PCR从Mhp J株扩增P52基因,克隆到表达载体pET-30a中,获得重组质粒pET-P52,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE和western blot检测重组蛋白表达及其免疫学活性.以该重组蛋白为抗原免疫兔制备抗血清,采用间接ELISA检测抗血清效价,并利用抗血清通过间接免疫荧光检测P52基因在AD-293细胞中的表达情况.结果表明,PCR扩增目的基因为1 202 bp,SDS-PAGE检测重组蛋白大小约52 ku,其表达量占菌体总蛋白的28%.Western blot检测表明,目的蛋白能与Mhp阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫活性.间接免疫荧光检测到P52基因在AD-293细胞中表达.本研究为构建P52蛋白腺病毒载体疫苗奠定了基础.     

猪肺炎支原体P102基因C末端序列的克隆及原核表达

应用DNA重组技术，将猪肺炎支原体P102的C末端基因克隆到pET-28a表达载体上，并构建了重组表达载体；将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21，用终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导5h，然后用Bug BusterTM Ni—NTAHis·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行纯化。ELASE检测结果表明：该蛋白具有良好的生物学活性。利用纯化蛋白制备高免血清为检测P102蛋白在真核系统中的表达奠定基础。     

牛支原体套式PCR检测方法的建立

为建立牛支原体检测方法,本研究采用牛支原体的oppD/F基因的两对特异性引物,建立了牛支原体的套式PCR检测方法.该套式PCR可以从100 ccu/mL(color change unit颜色变化单位)的牛支原体培养物中检出目的片段;同时还可以从病牛肺脏、病牛鼻拭子中扩增出目的片段,而且结果与病原分离结果一致.特异性试验结果表明,该方法与其它支原体无交叉反应,是一种特异性强、敏感性高的牛支原体检测方法.