研究肠道糖基化修饰的荧光凝集素免疫组化方法建立

糖基化修饰是生命体中最重要的一种蛋白质翻译后修饰之一，对生命体起着非常重要的作用。糖蛋白上的糖基可以作为凝集素的结合位点，因此凝集素可以用来鉴别和分析糖链结构，作为糖基化分析方法如质谱法的重要补充。本试验旨在建立和优化研究猪肠道糖基化修饰的荧光凝集素免疫组化方法，并应用该方法研究猪不同肠段糖基化修饰的差异以及断奶对仔猪肠道糖基化修饰的影响。结果表明：①荧光凝集素免疫组化方法最适条件为：切片脱蜡后，封闭切片30 min，采用5 μg/mL FITC标记植物凝集素（FITC-Lectin）室温孵育1 h，以含有DAPI的封片剂进行封片。该方法具有灵敏度高、特异性好以及定量更为多元化的特点。②生长猪回肠和结肠中糖基化修饰模式不同，回肠主要以岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺为主，而结肠中主要以N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖和甘露糖为主。除甘露糖分布在非杯状细胞的肠上皮细胞和固有层外，岩藻糖和N-乙酰葡萄糖胺主要分布在肠绒毛表面和杯状细胞中。③22~28日龄仔猪回肠中N-乙酰葡萄糖胺的含量随着仔猪日龄的增加而增加（P<0.05），断奶显著降低了28日龄仔猪回肠中N-乙酰葡萄糖胺的含量（P<0.05）。综上所述，本研究成功建立猪肠道糖基化修饰的研究方法，并通过此方法发现仔猪回肠中N-乙酰葡萄糖胺可作为肠道屏障功能完善的标志之一。     

食糜样本中11种生物胺同步检测方法的建立

旨在建立一种利用液质联用（liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS）技术实现对猪肠道食糜中多种生物胺进行同步检测的方法。试验首先优化了丹磺酰氯（dansyl chloride,DNS）对生物胺的衍生条件,并进一步确定了肠道食糜样品中生物胺的最佳净化方法。结果显示,衍生条件在衍生剂浓度为8 mg·mL^-1,衍生温度为40℃的条件下,衍生90 min为最佳。生物胺净化方法确定为先用乙酸乙酯进行提取,衍生结束后再用乙酸乙酯进行萃取的组合方式提取生物胺的效果最好;11种生物胺在5～1 000 μg·L^-1的质量浓度范围内定量结果呈良好的线性关系（R²>0.99）,检出限和定量限分别为0.01～0.23 μg·L^-1和0.03～0.76 μg·L^-1;各生物胺的日内相对标准偏差在0.73%～ 7.92%,日间相对标准偏差在0.07%～8.67%。最后采用本方法对仔猪回肠、盲肠、结肠和直肠食糜样品中的生物胺进行检测,初步确定了11种生物胺在不同肠段食糜中的含量分布。通过对仔猪回肠、盲肠、结肠和直肠中的食糜样品进行检测,发现食糜中的生物胺主要为亚精胺、腐胺、尸胺、精胺和组胺,而酪胺、1,7-二氨基庚烷、5-羟色胺和胍基丁胺4种生物胺含量较少,色胺和苯乙胺未检出。综上所述,本试验建立的方法具有结果准确、灵敏度高、重现性好等优点,可用于仔猪不同肠道段食糜中多种生物胺的同步检测。