应用竞争PCR定量检测猪IFN—γ mRNA

运用RT—PCR从经ConA体外刺激培养的猪外周血单核细胞(PBMC)提取的细胞总RNA中扩增猪γ—干扰素(IFN—γ)的部分片段，经酶切鉴定后双酶切缺失中间一小片段，将余下的2个较大片段连接，并用相同的引物在相同条件下扩增连接产物，从而获得截短的同源性片段。将其纯化后克隆于pMDl8—T载体，重组质粒经酶切和PCR鉴定后进行序列测定，验证无误后作为竞争性模板内对照，一定比例稀释后分别与等体积经刺激培养的PBMC总RNA反转录产物进行PCR，产物电泳后经扫描分析获得各目标条带与竞争条带的溴化乙锭(EB)嵌入光密度值(IOD)，经校正后取上述两者比值的对数值作为Y轴，取已知竞争模板相应浓度的对数值作为X轴，绘制成竞争曲线。应用建立的竞争PCR对不同样品重复试验表明，本方法操作简单，结果可靠，稳定性高，适用于猪IFN—γ mRNA的定量检测。     

抗牛白血病试验羊肿瘤细胞膜抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

建立4株分泌抗牛白血病试验羊肿瘤细胞膜抗原(TAA)单克隆抗体细胞株,用抗鼠 Ig 亚类标准血清双扩证明4株均为 IgG,轻链为 K,染色体数平均为104.3次克隆,4次复苏,4个月传代培养,细胞分泌抗体稳定.用 TAA 包被的 ELISA 检测证明免疫鼠血清、单克隆抗体呈阳性反应,健康鼠血清呈阴性反应.中和试验 OD值与健康对照相同,抑制试验单抗 OD 值明显下降.建立了完整细胞包被的 ELISA 和间接免疫荧光检测试验羊肿瘤细胞的方法,并证明瘤细胞膜呈阳性反应,而健康羊外周淋巴及淋巴结中的淋巴细胞呈阴性反应,表现了很高的特异性,为提高牛白血病肿瘤细胞诊断和研究其肿瘤细胞发生提供了新试剂.     

茨城病的琼脂免疫扩散试验诊断

茨城病 ( Ibaraki disease ID)又称类蓝舌病 ,是由茨城病病毒引起的虫媒性传染病 ,该病毒属呼肠孤病毒科 ( Reovividae)环状病毒属 ( Orbivirus)的成员。其特征为突发高热、精神沉郁、口鼻黏膜溃疡、吞咽困难、蹄冠肿胀。该病曾在日本多次流行 ,当时误认为流行性感冒。1 961年 Omori首先从茨城的病牛中分离到病毒 ,并命名为茨城病毒。在 1 991年的国际病毒分类委员会会议上才予以确认。该病在日本的南九州地区、关东地区的茨城县、爱知县和歧阜县等地多次发生。除日本外尚有韩国、澳大利亚、加拿大、印度尼西亚和菲律宾等国有发生本病的…     

抗蓝舌病病毒VP7和NS2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为建立蓝舌病病毒(BTV)的检测方法和研究该病毒蛋白的功能,本研究利用BTV血清8型(BTV8)免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备单克隆抗体(MAb).并以BTV8作为包被抗原建立间接ELISA方法,经筛选获得了8株稳定分泌抗BTV8 MAb的杂交瘤细胞株(1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4和4D12).Western blot结果显示,MAb 1F6、2B1、2D10、3B6、3D9与BTV8 VP7蛋白反应,MAb B2、4D4、4D12与BTV8 NS2蛋白反应.间接免疫荧光结果显示,该8株MAb与24型BTV血清型呈不同的反应论系.本研究所获得的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究提供了实验依据.     

赤羽病病毒核衣壳蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的重组赤羽病病毒核衣壳蛋白作为诊断抗原，建立了检测牛血清特异性核衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法，初步组装成便于现地使用的试剂盒。经对试验条件进行优化，确定最佳抗原包被量为每孔1μg（100μL），样品稀释度为1：100，兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1：8000。经特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。应用初步研制的间接ELISA试剂盒和微量中和试验法分别对云南省的89份、内蒙古的100份牛血清样本进行了检测，以中和试验为参照，经统计学处理，得出检测临界值分别为0．411和0．303，2种方法的符合率分别为72．7％（56／77）和91．4％（85／93）。试剂盒在37℃保存3d，对敏感性无明显影响。     

库存年份对小麦和水稻种子发芽率及籽粒特性的影响

测定库存1～10 a小麦、水稻种子的发芽率、水分以及粗蛋白质等指标,明确种质资源库(常温)保存的种质发芽率、籽粒特性与保存时间的关系。结果表明,库存种质发芽率随着保存年份的增加而降低;籽粒水分随保存年份的增加呈升高趋势。品质分析表明,随保存年份的增加小麦硬度呈下降趋势,粗蛋白质含量呈现波浪式升高趋势,湿面筋含量、沉降值均呈缓慢升高趋势;水稻随保存年份的增加籽粒硬度、胶稠度呈下降趋势,粗蛋白质含量呈现波浪式升高趋势,而直链淀粉无明显规律。种质更新周期小麦为8 a、水稻为5 a。     

断奶仔猪猪舍的设计和实用化管理

随着养殖业规模化集约化生产的发展,断奶仔猪猪舍的设计与推广越来越受到人们的重视。本文就断奶仔猪猪舍的设计和实用化管理的发展过程,实际存在的问题做了详细的分析,并给出了相应的策略。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗和变异株灭活疫苗的免疫效果评价

分别采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1R致弱毒疫苗株和变异毒株灭活疫苗免疫接种40日龄～45日龄仔猪,免疫接种后4周,用高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN-4变异株强毒攻毒,攻毒后21 d剖检,取主要器官作病理组织学观察和病毒抗原定位.结果显示变异毒株灭活疫苗免疫攻毒后导致的病理变化和病毒抗原分布程度均明显高于CH-1R弱毒疫苗免疫组.免疫病理学研究结果表明CH-1R 弱毒疫苗对HU-4株强毒免疫保护效果好于变异毒株灭活疫苗.     

禽流感病毒A/PFV/Restock/34(H7N1)HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV／Restock／1／34（H7N1）1．7kbHA基因的cDNA，将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis，筛选到重组质粒命名为pBlueBacHisH7HA，测序正确后与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-Blue^TMDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经三轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rpBlueHisH7HA。提取重组病毒DNA，经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中，血凝实验、SDS-PAGE和Western blot实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得了表达。     

马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏茵中表达及其多克隆抗体制备

采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞（PBMC）中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素（Equine interferon-γ，EIFN-γ）基因，将其克隆至载体pCR2．1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒（pCR-EIFN-γ）中扩增马干扰素成熟蛋白（MatureEIFN-γ，mEIFN-γ）基因，并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）。重组子经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，将纯化后的表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。结果表明，mEIFN-γ基因全长为441b口，含一个开放阅读框，编码146个氨基酸的成熟蛋白；对其表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在，重组蛋白相对分子量约为18Ku，且具有免疫反应活性。mEIFN-γ基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下，采用Ni^＋亲和层析纯化方法均可获得高纯度的重组马γ-干扰素制备的多克隆抗体，为建立马γ-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。