PRRSV GP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的ORF5核酸片段ORF5NC,分别克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBacHTA-ORF5及截短表达的重组转移载体pFastBacHTA-ORF5NC。将供体质粒分别转化DH10Bac细胞,获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,在Sf9细胞中分别成功表达了全长的GP5重组蛋白和缺失信号肽、跨膜区的截短GP5重组蛋白。2种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法检测免疫GP5全长和截短重组蛋白的小鼠血清中抗体滴度分别为1∶800和1∶1 600,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验为进一步分析重组蛋白诱导中和抗体产生的能力以及为PRRSV基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。     

Sn受体N端V-set结构域和CD163受体SRCR5结构域在PRRSV-ADE感染中的作用

为了研究Sn受体N端V-set结构域和CD163受体SRCR5结构域在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)抗体依赖性增强作用(ADE)感染中的作用,对2种结构域蛋白进行表达、纯化,并免疫大白兔制备其特异性多克隆抗体IgG。应用制备的抗Sn-N-V-set IgG、CD163-SRCR5 IgG和正常兔IgG分别封闭PAMs细胞,然后使用猪抗PRRSV IgG与PRRSV悬液混合后制成的感染性免疫复合物感染已封闭的PAMs细胞。感染后每隔12 h收集细胞上清液1次,用已建立的实时荧光定量RT-PCR方法测定PRRSV的RNA拷贝数,同时以Marc-145细胞测定PRRSV的病毒滴度。结果显示,当Sn受体N端V-set结构域和CD163受体SRCR5结构域被其特异性抗体封闭后,能够显著抑制体外PRRSV感染PAMs细胞的抗体依赖性增强作用(ADE)(P<0.01)。结果表明,2种受体结构域均参与PRRSV-ADE感染。     

针对不同形式猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白的抗体中和活性比较

GP5蛋白被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导中和抗体的主要蛋白,为探讨GP5蛋白诱导免疫保护的能力,本研究用杆状病毒/昆虫表达系统分别表达了全长和截短的GP5蛋白,同时用大肠杆菌表达系统表达了截短的GP5蛋白。三种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,以PRRSV全病毒作为ELISA包被抗原检测抗血清时,原核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶200,真核表达的全长GP5蛋白抗血清效价为1∶800,真核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶1 600。将获得的三种抗血清分别在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)进行PRRSV同源(PRRSV VR2332)和异源(PRRSV HeN-3)毒株的血清学中和试验,并通过实时定量PCR方法检测各组中PRRSV mRNA的绝对拷贝数,以抗血清的病毒阻断率≥70%的最大血清稀释度作为该血清的中和效价。结果显示:1)三种重组蛋白的抗血清对两种PRRSV毒株的中和效价均1∶2,不具有中和活性,部分稀释滴度的血清还增强了病毒的感染;2)抗PRRSV全病毒对照阳性血清对同源毒株的中和效价为1∶8,具有中和活性;对异源毒株的中和效价1∶2,不具有中和活性,同时还产生了ADE增强作用。上述研究结果提示,GP5的主要中和表位可能更多是构象表位,PRRSV全病毒中主要诱导中和抗体产生的蛋白可能并不完全在GP5蛋白上;PRRSV全病毒阳性抗血清虽然能够提供一定的免疫保护,但这种免疫保护只发生在同源毒株之间,对异源毒株并没有效果,反而会介导ADE效应发生。     

猪源铁蛋白重链亚基纳米粒的制备

根据Gen Bank公布的铁蛋白重链基因序列,设计出1对特异性引物;提取猪心脏总RNA,采用RT-PCR方法扩增出铁蛋白重链亚基基因片段,经测序正确后,再将双酶切的纯化产物与PET32a原核表达载体相连接,构建重组质粒、把测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。将表达的重组蛋白用Ni~+离子亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的表达产物。将鉴定正确的铁蛋白产物置于透射电镜下观察其表征,以进一步鉴定铁蛋白纳米颗粒是否自组装成功。结果表明,本研究成功表达并纯化出了猪源铁蛋白重链亚基,而透射电镜下观察到了大量直径为10~13 nm的颗粒,说明重组猪源铁蛋白重链纳米粒自组装成功。     

2015-2020年FAdV-4安徽流行株全基因组测序分析及不同感染途径的致病性研究

为探讨血清4型禽腺病毒（FAdV-4）安徽流行株的基因组遗传变异特征及其感染途径与致病性的关系,选择2015-2020年6株FAdV-4安徽分离株进行全基因组测序与分析,并以CH/AHMC/2015株对10日龄SPF鸡进行不同感染途径（皮下注射、口服、点眼、滴鼻及其分别同群混养）的致病性试验。结果显示,6株FAdV-4安徽分离株的基因组全长均为43 719～43 723 nt,其核苷酸同源性达99.97%,与国内FAdV-4主要流行株同源性为99.56%～100%,与国外经典毒株ON1、KR5、MX-SHP95同源性为98.45%～98.78%;6株病毒与国内代表株HB1510具有13个核苷酸位点差异,并导致5个位点氨基酸变化,与国外经典毒株存在特征性差异。氨基酸分析显示,Hexon蛋白aa188、Fiber-2蛋白aa219和aa380 3个氨基酸位点存在一定的特征性,致病株主要为R、D、T,非致病株主要为I/V、G、A。进化分析显示,国内FAdV-4流行株与巴基斯坦、印度分离株的遗传关系最近。感染试验显示,皮下注射、口服、点眼、滴鼻4 组人工感染鸡的发病率和死亡率分别为100%、55%、50%、60%和90%、20%、40%、50%,各组同群混养鸡的发病率为20%～40%,仅皮下注射组混养鸡出现死亡,死亡率为20%。结果表明,2015-2020年FAdV-4安徽省流行株具有国内主要流行致病株特征,其不同感染途径的结果进一步揭示该病的临床流行特点,为该病防制提供科学依据。     

地方本科高校动物传染病检测技术课程案例教学法探析

动物传染病检测技术是面向地方高校动植物检疫及相关专业本科生开设的一门具有较强专业性的课程,传统的偏重理论知识而轻视实践操作的本科生人才培养模式已无法适应该课程的教学目标。案例教学法打破了传统的课堂教学形式,促使理论与实践有效融合,增强了学生的学习兴趣,激发了学生的发散思维和创新意识,提高了学生理论联系实际、解决动物传染病防控中实际问题的综合能力,对新形势下我国地方高校本科生应用型人才培养目标的快速实现具有积极的推动作用。     

不同包被抗原检测PRRS抗体间接ELISA方法的建立

为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT-PCR方法分别扩增出PRRSV VR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,成功构建重组质粒pET-32a-GP4、pET-32a-N和pET-32a-GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4-N融合蛋白,并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原,通过不断优化反应条件,最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体,并与商品化试剂盒进行比较,结果显示,GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82.7%,N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87.2%,GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85.5%;因此,N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。