Construction of Recombinant Expression Plasmid pYELmleA of mleA Gene and Expression in Saccharomyces cerevisiae

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的功能酶。笔者进行酒酒球菌SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因重组表达质粒的构建。利用来自重组质粒pLmleA的，mleA基因，以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件。以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleA，并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。SDS—PAGE检测表明获得的转化子表达了约60KD的目标蛋白。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中。获得的转化子在添加了L-苹果酸的培养基中培养4d；取培养液上清用HPLC检测L-苹果酸及L-乳酸含量，采用t检验进行差异显著性分析，结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将L-苹果酸转化成L-乳酸，L-苹果酸和L-乳酸含量分别与对照差异极显著和显著，L-乳酸的生成量为1002—1106mg／L。苹果酸的相对降低率为19．16—22．34％。     

Construction of Recombinant Expression Plasmid pYELmleA of mleA Gene and Expression in Saccharomyces cerevisiae

苹果酸－乳酸酶是进行MLF的功能酶。笔者进行酒酒球菌SD-2a的苹果酸－乳酸酶基因重组表达质粒的构建，利用来自重组质粒pLmleA的mleA基因，以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以大肠杆菌－酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleA，并转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS58。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了约60KD的目标蛋白，斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到     

苹果渣发酵生产饲料蛋白的培养基

采用经试验所筛选出的菌种组合,就4种无机氮源和作为辅料的12种农产品加工中的副产品或废弃物,对苹果渣发酵生产词料蛋白的影响进行了试验研究,并确定了苹果渣发酵生产饲料蛋白的配方。试验结果表明,在苹果渣发酵中,可混合使用尿素和硫酸控作为无机氮源,添加量为尿素1、5％,硫酸铵2％。所选12种农产品加工副产品或废弃物均可作为辅料使苹果渣发酵生产饲料蛋白,所得发酵产物粗蛋白提高率均较显著,但选择麸皮与豆饼、菜籽饼、棉籽饼、啤酒糟等配合使用更为合适。     

玉米秸秆发酵剂优良菌种的筛选

采用常规方法从800余株菌(包括丝状真菌、酵母菌、链霉菌、细菌)中筛选到6株优良菌种,并进行了原料配方发酵试验与多菌株组合发酵试验。在实验室条件下,发酵剂粗蛋白含量高达42lmg·g-1,比发酵剂原料本身粗蛋白含量提高26.4％,活菌数达4.3×10个·g-1以上。筛选到的菌株是研制玉米秸秆发酵剂的优良菌种。     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA的克隆

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的关键酶.该研究以酒类酒球菌31DH(Oenococcus oeni 31DH)的基因组DNA为模板进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA的PCR扩增.PCR引物为5'-CGGAATTCATGACAGATC-CAGTAAGTAT-3'和5'-TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT-3',引物的5端分别引入EcoRI和KpnI酶切位点.得到的PCR产物约1.6kb.PCR产物回收后用EcoRI-KpnI双酶切,与经同样双酶切的质粒YEp352(大肠杆菌-酵母穿梭载体)进行连接并转化大肠杆菌感受态细胞,筛选重组质粒并用酶切及PCR验证.获得的酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的重组质粒命名为pLmleA.     

Oenococcus oeni MLF关键基因在酿酒酵母中的转化与表达

利用西北农林科技大学葡萄酒学院筛选出的酒酒球菌(Oenococcus oeni )优良菌系SD-2a的包含苹果酸-乳酸酶基因(mleA)和苹果酸通透酶基因(mleP )约2.6 kb的基因片段，并以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以酵母-大肠杆菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleAP，转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58，筛选获得酵母转化子YS58/pYELmleAP。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中，SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了苹果酸-乳酸酶的目的蛋白。对酵母转化子培养上清进行HPLC检测，采用t检验差异显著性分析，结果表明mleA基因在受体菌中进行了功能性表达。获得的酵母转化子在添加L-苹果酸的SD/-Ura培养基中培养4 d，培养液中的L-苹果酸含量降低，培养液上清中L-苹果酸的剩余含量比空载体转化子极显著降低，苹果酸降低19.33%～19.42%。对照未检出乳酸的生成，供试的转化子L-乳酸生成量为1249～1368 mg/L，与对照差异显著。     

饲用微生物的分子改良技术与方法

随着基因组测序等现代生物技术实现突破,基因组学、蛋白质组学、代谢组学等多门"组学"及生物信息学、系统生物学等学科得到迅猛发展,微生物育种理论和技术也发生了重大变革。以基因组改组、基因工程、蛋白质定向进化和代谢工程为代表的现代微生物分子改良技术逐渐成为了世界微生物育种研究的主流,在我国也正在成为饲用微生物遗传改良的重要手段。文章简要介绍了饲用微生物分子改良的技术与方法,分析了分子育种面临的生物安全性问题,探讨了未来我国饲用微生物分子改良的发展战略。     

酿酒酵母DL28转化产γ-氨基丁酸主要影响因子的筛选

[目的]筛选出对酿酒酵母重组菌转化产生γ-氨基丁酸(GABA)具有影响的主要因素。[方法]利用Plackett-Burman试验设计对谷氨酸脱羧酶基因(GAD 1)高效表达重组菌Saccharomyces cerevisiae DL28转化产GABA的主要影响因子,如菌体浓度、底物浓度、转化温度、转速、转化时间及起始pH等进行研究,筛选出主要影响因素。[结果]试验表明,菌体浓度(P=0.012 3)、转化时间(P=0.047 5)及起始pH(P=0.001 9)对转化产生GABA具有显著影响。[结论]研究可为进一步优化菌株DL28产GABA转化条件提供理论依据与实践基础。