云南和广东省流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6)的分离与遗传特性

【目的】分离流行于我国南方地区的流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6),掌握分离毒株的遗传特征。【方法】对设立于我国云南和广东省的哨兵动物定期采血,进行EHDV感染情况监测与病毒分离培养。通过血清中和试验确定分离EHDV的血清型,采用一步法RT-PCR对分离的EHDV-6毒株基因节段2、3、6(Seg-2、-3、-6)进行扩增与序列分析。【结果】2012—2016年,从云南省和广东省的哨兵动物中分离出25株EHDV毒株,其中,11株为EHDV-6型。中国EHDV-6型毒株的Seg-2、-3与-6均属Eastern型,核酸序列相似性分别为99.1%、98.9%和98.8%,在系统发生树上分别聚为1个独立的中国支系。在日本引起疫病暴发的EHDV-6型毒株与中国EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系。日本EHDV-6型毒株在系统发生树上处于中国支系内部,Seg-2、Seg-3与中国毒株的核酸序列相似性分别为98.5%和93.9%。【结论】云南和广东省流行的EHDV-6型毒株核酸与氨基酸序列高度相似;日本和中国的EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系,提示中日之间可能存在EHDV的流动。研究结果为进一步开展我国EHDV-6型毒株流行病学分析、致病性、病原学诊断与疫苗制备等研究提供了基础。     

肺炎克雷伯氏菌强毒株的分离鉴定及16-23SrRNAITS序列分析

为确诊疑似仔猪肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)感染,并研究其病原的致病性、耐药性、16-23SrRNA ITS系统进化特征,本研究从云南因肺炎、腹泻而大量死亡的仔猪中分离到1株革兰氏阴性短粗杆菌,命名为KP14013,对其进行生化鉴定、16SrRNA鉴定,研究其对小白鼠和仔猪的致病性,并对其16-23SrRNA ITS基因进行测序和遗传进化分析。结果显示,KP14013分离株生化特征与肺炎克雷伯氏菌相符,其16SrRNA与GenBank中23株肺炎克雷伯氏菌代表株之间的同源性均为99%,将KP14013鉴定为肺炎克雷伯氏菌。KP14013对小白鼠半数致死量(LD50)为3×101.8 CFU,腹腔注射3×108 CFU可使仔猪100%致死。16-23SrRNA ITS系统进化关系结果表明,KP14013与GenBank中收录的15株肺炎克雷伯氏菌形成进化树的一个分支,属于同一个亚群,它们之间的核苷酸同源性为98.4%~99.2%。本研究证实了肺炎克雷伯氏菌是该起仔猪腹泻大量死亡的病原;KP14013分离株为毒力极强菌株,具有多重耐药性,其16-23SrRNA ITS与GenBank中收录的肺炎克雷伯氏菌代表株之间核苷酸存在差异,可用于肺炎克雷伯氏菌菌株间的鉴别。     

添加真菌培养物对人工瘤胃pH和挥发性脂肪酸产量及比例的影响

用瘤胃持续模拟技术研究玉米和稻草在瘤胃内发酵产生总挥发性脂肪酸 (TVFA)量、VFA能。结果表明 :添加A、B、C、D、E和F 6种真菌培养物发酵的玉米和稻草 0～ 72h的TVFA每 10 0mL中分别为 5 .0 7,4 .31,8.77,4 .30 ,9 75 ,3.32mmol和 4 .0 9,2 .36 ,8.6 8,7.6 6 ,9.95和 2 .94mmol,发现以E菌处理的产酸量和VFA能最高     

用乙基环丙沙星重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞

为重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞,本研究采用药物乙基环丙沙星,先测出该药对大肠杆菌的最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),再测出该药对BHK-21细胞的MIC,从而确定10 mg/L为乙基环丙沙星不影响细胞生长,又能抑制大肠杆菌的安全浓度。然后用含该浓度乙基环丙沙星的MEM生长液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理。经过3次循环处理,再传3代后,确认大肠杆菌污染已经被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受细菌污染的细胞提供了参考。     

荧光定量RT-PCR测定口蹄疫病毒悬液内病毒颗粒抗原含量方法研究

口蹄疫病毒完全颗粒(146S)含量是影响疫苗质量的重要因素。在抗原生产过程中对口蹄疫病毒颗粒含量进行监控,能够保证不同批次的口蹄疫疫苗抗原含量均达到疫苗生产质量要求。本研究应用荧光定量RT-PCR方法,结合应用口蹄疫146SELISA抗原定量技术定量的抗原作为荧光RT-PCR定量的标准对照抗原,利用两种方法分别检测倍比稀释的标准抗原,研究RT-PCRCt值与口蹄疫病毒146S抗原含量的相关关系。研究结果表明,口蹄疫RT-PCR的Ct值与口蹄疫病毒146S抗原含量log2的对数值间呈负线性相关关系。荧光定量RT-PCR可以用于口蹄疫病毒颗粒灭活前抗原含量的快速测定,可为口蹄疫疫苗生产质量控制提供一种新的检测方法。     

二辛可宁酸试剂定量蛋白质与口蹄疫抗原的研究

二辛可宁酸(bicinchonininc acid,BCA)可用于精确定量蛋白质。用不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化口蹄疫146S抗原。BCA试剂定量0～200 μg/ml的白蛋白和该纯化抗原,紫外分光光度计560 nm波长读取结果（OD值）,白蛋白检测结果用SPSS软件进行线性和回归分析,发现数据相关性、线性显著,计算出了回归方程,绘制出了蛋白质含量与OD值之间的标准曲线。将纯化抗原的数据代入回归方程计算出该抗原的含量。     

单细胞克隆技术提纯分化的IBRS-2细胞研究

IBRS-2细胞出现分化变异影响使用,为不影响正常的科学研究,本研究采用单细胞克隆的方法重新提纯,用96孔板经过3周的独立培养后,将具有代表性的4株进行扩增,然后用已知毒价的口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)弱毒分别对其进行接毒试验和TCID₅₀测定。结果表明,B1株克隆细胞的病变最为理想,其TCID₅₀为7.60,比提纯前的4.52更接近实际毒价7.85,且和实际毒价无显著差异。     

2013—2019年我国流行性出血病病毒血清1型毒株的分离与遗传特征分析

【目的】掌握流行性出血病病毒（Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV）血清1型毒株（EHDV-1）在我国南方地区的流行情况及其遗传特征,为开展EHDV-1血清型特异性诊断、流行病学调查和致病性研究提供科学依据。【方法】2013—2019年通过在我国云南、广东和广西设立牛羊虫媒病毒监控点和哨兵牛,定期采集哨兵牛血液样本进行虫媒病毒分离;通过微量中和试验确定EHDV分离株的血清型,然后对EHDV分离株的部分基因节段（Seg-2、Seg-3和Seg-6）进行RT-PCR扩增、双向测序及序列分析,并利用BioEdit计算EHDV基因组各节段核苷酸序列及其推导氨基酸序列的相似性。【结果】2013—2019年从云南、广东及广西的虫媒病毒监控点共分离获得33株EHDV,其中7株为EHDV-1型毒株。分离获得的7株EHDV-1型毒株Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列高度同源,其平均相似性分别为（97.65±1.51）%、（94.87±4.72）%和（97.61±1.41）%,对应的推导氨基酸序列相似性平均为（97.69±1.36）%、（99.49±0.32）%和（97.51±2.47）%。基于Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树均显示,不同EHDV-1型毒株可划分为东方（Eastern）和西方（Western）2种地域型,东方地域型毒株分离自中国、日本及澳大利亚,西方地域型毒株主要来源于美洲和非洲。在基于Seg-2核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株归属于西方地域型,且聚类形成一个相对独立的进化分支;在基于Seg-3核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株分属2种地域亚型（Eastern-1和Eastern-2）,分别与日本EHDV-1型和EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系;在基于Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中,分离获得的7株EHDV-1型毒株属于东方地域型,与日本EHDV-1型毒株具有较近的亲缘关系。【结论】EHDV-1型毒株已在我国南方地区广泛流行,其Seg-2和Seg-6序列分别具有最近的共有祖先病毒,而Seg-3序列来自不同的祖先病毒。西方地域型毒株Seg-2序列在我国流行EHDV-1型毒株中的出现,说明西方地域型毒株在侵入我国后可能与本土流行的毒株发生重配,即我国流行EHDV-1型毒株为西方地域型与东方地域型的重配型毒株,为防范强致病性西方地域型毒株传入我国而造成畜牧业重大经济损失提供了警示。     

流行性出血病病毒血清分型RT-PCR方法的建立及应用

以决定流行性出血病病毒(EHDV)血清型的第二基因节段(Seg-2)为检测靶基因,设计7对特异性引物,建立用于鉴定EHDV血清型的RT-PCR检测方法,并通过对扩增产物的测序,进一步了解病毒Seg-2的遗传特性。特异性试验结果显示,该检测方法可准确鉴定不同血清型的EHDV毒株,与蓝舌病病毒、中山病病毒、阿卡斑病毒均无交叉反应;灵敏度试验结果显示,对不同血清型EHDV核酸的检测下限均可达10~2拷贝;对我国不同时间与不同地域分离的EHDV毒株进行血清型RT-PCR鉴定,结果显示分离的31株EHDV分属EHDV-1、-5、-6、-7与-10型等5种血清型,与血清中和试验的鉴定结果完全吻合。以上结果表明,该方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,可快速准确地鉴定EHDV毒株的血清型。