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为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)可视化反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法，本研究根据PEDV ORF1a/b基因的保守序列，设计了8组特异性引物，以PEDC cDNA为模板，采用试剂盒推荐的各反应条件经LAMP扩增，根据LAMP反应产物琼脂糖凝胶电泳结果筛选最佳引物组。以筛选的外引物PE2 F3/B3经PCR从PEDV cDNA中扩增ORF1a/b基因，构建重组质粒p PE-ORF1-2并分别经PCR和测序鉴定。结果显示，2号引物组(内引物PE2 FIP/PE2 BIP，外引物PE2 F3/PE2 B3)为最佳引物。PCR和测序鉴定结果表明重组质粒正确构建，经计算其浓度为1.56×1011拷贝/μL，将其稀释1 000倍后作为质粒标准品。为建立检测PEDV的RT-LAMP方法，本研究对该方法的反应时间、反应温度、Mg2+浓度、内、外引物及d NTP浓度进行了优化，结果显示，RT-LAMP反应体系为：60℃反应50 min,Mg2+浓度80 mmol/L，内外引物终浓度分别为32μmol/L和5μmol/L,d NTP浓度10 mmol/L；通过在上述体系中加入甲酚红指示... 相似文献
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