5种常见犬腹泻病毒基因芯片检测方法的建立

为建立一种简便、快速、高效的可同时区分犬腺病毒1型(canine adenovirus type 1,CAV-1)、犬腺病毒2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)、犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)、犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)、犬细小病毒(canine parvovirus,CPV) 5种常见犬腹泻病毒的基因芯片诊断方法,本研究以CAV-1、CAV-2、CCV、CDV、CPV 5种犬腹泻病毒为靶病毒,根据NCBI上收录的病毒基因序列在其保守区域内设计引物,在此基础上根据变异区域设计针对每种病毒的探针2～3条,优化检测体系的各反应条件,确定该检测方法的特异性与敏感性,建立可同时区分5种病毒的基因芯片检测方法。结果显示,建立的基因芯片检测方法可同时检测以上述5种犬腹泻病毒,其中PCR的退火温度为55℃、延伸时间为1 min 15 s;探针与PCR产物的杂交温度40℃、杂交时间2.5 h时,该方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒标准品的检测限分别为0.2 fg/μL、2 fg/μL、2 fg/μL、20 pg/μL和0.02 fg/μL,具有较高的灵敏性;同时对犬副流感病毒进行特异性试验,发现无阳性信号出现,具有较强的特异性;对14份临床腹泻样品检测结果显示,基因芯片方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒的阳性检出率分别为28.57%、50.00%、64.28%、14.28%和85.71%,并且基因芯片检测方法的敏感性较PCR要高10～100倍。以上结果表明,本研究建立的基因芯片检测方法具有特异、敏感等特点,对临床中犬类混合感染病毒检测具有一定的诊断意义。     

5种常见犬腹泻病毒基因芯片检测方法的建立

为建立一种简便、快速、高效的可同时区分犬腺病毒1型（canine adenovirus type 1,CAV-1）、犬腺病毒2型（canine adenovirus type 2,CAV-2）、犬冠状病毒（canine coronavirus,CCV）、犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）、犬细小病毒（canine parvovirus,CPV） 5种常见犬腹泻病毒的基因芯片诊断方法,本研究以CAV-1、CAV-2、CCV、CDV、CPV 5种犬腹泻病毒为靶病毒,根据NCBI上收录的病毒基因序列在其保守区域内设计引物,在此基础上根据变异区域设计针对每种病毒的探针2~3条,优化检测体系的各反应条件,确定该检测方法的特异性与敏感性,建立可同时区分5种病毒的基因芯片检测方法。结果显示,建立的基因芯片检测方法可同时检测以上述5种犬腹泻病毒,其中PCR的退火温度为55℃、延伸时间为1 min 15 s;探针与PCR产物的杂交温度40℃、杂交时间2.5 h时,该方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒标准品的检测限分别为0.2 fg/μL、2 fg/μL、2 fg/μL、20 pg/μL和0.02 fg/μL,具有较高的灵敏性;同时对犬副流感病毒进行特异性试验,发现无阳性信号出现,具有较强的特异性;对14份临床腹泻样品检测结果显示,基因芯片方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒的阳性检出率分别为28.57%、50.00%、64.28%、14.28%和85.71%,并且基因芯片检测方法的敏感性较PCR要高10~100倍。以上结果表明,本研究建立的基因芯片检测方法具有特异、敏感等特点,对临床中犬类混合感染病毒检测具有一定的诊断意义。     

副猪嗜血杆菌、PCV2及PRRSV多联RT-PCR检测方法的建立及其应用

副猪嗜血杆菌(H.parasuis)、猪圆环病毒2型(PCV2)及猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)是引起猪呼吸系统疫病的3种重要病原,根据GenBank中这3种病原的基因组序列,选择基因序列的高保守区,分别设计合成了3对特异性引物进行3种病原的多重PCR,并对反应条件进行优化。利用建立的多重PCR方法,对河北省2012-2013年发生呼吸系统疾病的412份猪病料进行检测,并随机选择其中的57份,同时进行单一PCR检测,以确定2种方法检测结果的符合程度。结果表明,3对引物能特异扩增出大小分别为469,829,219bp的目的条带。灵敏度检测试验表明,H.parasuis,PCV2和PRRSV的最低检测量分别为52.7,335.0,137.0pg。412份临床样品检测结果显示,H.parasuis在2012年的阳性率为44.2%,2013年为45.1%,提示这2年引起猪呼吸道疫病的主要病原是H.parasuis。     

犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒三重PCR检测方法的建立

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCV)的基因序列保守片段分别设计特异性引物,建立了可以同时检测CDV(684 bp)、CPV(213 bp)和CCV(417 bp)的三重PCR方法。特异性结果表明,所建立的体系只能扩增CDV、CPV、CCV,而不能扩增犬腺病毒Ⅱ型(CAV-Ⅱ)和犬副流感病毒(CPIV);敏感性试验表明,该方法对CDV、CPV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10-2、6.0×10-2和6.7×10-2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。采用建立的三重PCR方法对北京、山东地区收集的临床粪便样品进行检测结果表明,使用三重PCR体系的扩增结果与单项PCR扩增结果一致,符合率为100%。以上结果表明该方法快速、敏感、特异性强,对上述3种病毒能够进行快速鉴定诊断,为临床诊断提供了快速简便的方法。