H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4 660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白...     

水稻表达HA蛋白为探针研制H9亚型禽流感抗体半定量快速检测试纸

建立一种禽流感H9亚型抗体半定量快速检测试纸,用于H9亚型禽流感(AIV)抗体的评价。含HA蛋白水稻粉末用提取液溶解后,离心,取上清,即为HA蛋白粗提液。其经过Q阴离填料和HA单抗亲和纯化,通过SDS-PAGE鉴定,重组HA蛋白纯度达到90%以上。利用胶体金标记纯化HA蛋白为探针,兔抗鸡IgG和HA的多抗分别作为检测线和质控线,依据高致病性禽流感HI诊断技术标准,建立一种适用于监测AIV H9亚型的半定量试纸检测方法。结果表明：胶体金标记HA蛋白量为30 mg/L,兔抗鸡IgG和HA多抗最佳包被质量浓度分别为1.0和1.2 g/L。试纸检测H9N2亚型阳性血清(HI为11 log₂)的最低检出限是1∶12 800,这相当于HI效价的4 log₂。试纸与H5 AIV、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)和马立克病病毒(MDV)阳性血清以及H9亚型阴性血清无交叉反应,在室温下至少能保存6个月,与HI试验平行检测比较,两者的符合率为90.6%。因此本试验研制了一种简单、快速、准确、特异的半定量免疫层析试纸,适用...