基于N蛋白小反刍兽疫病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立一种小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的快速检测方法,本研究将pET-32a-N重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达、纯化获得重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,制备了抗PPRV-N蛋白的单克隆抗体并进行HRP标记,通过优化反应条件建立了PPRV阻断ELISA抗体检测方法。经评价该方法与PIV、GTPV、ORFV的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶160稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(C_v)均小于10%;通过对180份临床血清样品进行检测,该方法与竞争ELISA试剂盒的符合率为96%。表明建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、敏感性与可重复性,可用于PPRV抗体的检测,为PPRV疫苗的免疫效果评估及疫病防控提供了技术支持。     

山羊痘病毒P32基因的截短表达及间接ELISA方法的建立和应用

为建立一种山羊痘病毒(GTPV)抗体快速检测方法,通过PCR技术扩增了P32蛋白优势抗原区(2-141AA)基因序列,将其连接至原核表达载体pET-28a(+)上,转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后获得了重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明该蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。以重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立了快速检测GTPV抗体的间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性、敏感性与可重复性,为GTPV的免疫抗体检测及流行病学调查提供了一种血清学诊断方法。     

小反刍兽疫病毒Ⅱ系与Ⅳ系毒株SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)Ⅱ系与Ⅳ系毒株SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR的鉴别检测方法，针对PPRV-H基因的高变区域设计1对特异性引物，确定反应条件，分析其敏感性和特异性，并对临床样本进行验证。60℃退火、76℃收集荧光信号获得试验效果最好，熔解曲线为单一峰，Ⅱ系毒株熔解温度78.63℃,Ⅳ系毒株熔解温度80.08℃,易于区分；最低检测限为10拷贝/μL,批内、批间变异系数均小于0.5%,羊口疮病毒(ORFV)等4种病毒无扩增曲线产生；检测140份临床样本，与国家标准检测方法结果符合率100%。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR检测方法可以快速、灵敏和特异地鉴别检测出PPRVⅡ系与Ⅳ系毒株，满足疫病快速诊断的需求。     

NaCl胁迫处理对采后马铃薯见光绿变的影响

为探究NaCl胁迫处理对采后马铃薯见光绿变及龙葵素生成的影响,本试验先将马铃薯块茎置于20% NaCl溶液中分别浸泡6 h和12 h,后置于光照条件下进行试验。结果表明：与见光对照相比,2个处理均显著提高了马铃薯的综合感官品质,货架期延长1倍;NaCl溶液处理较好地抑制了马铃薯表皮绿变,在同一光照时间,处理马铃薯表皮a*、叶绿素含量显著低于对照组;8天货架期后,2个处理马铃薯龙葵素含量显著低于见光对照组,8天货架期间,对照龙葵素增加了122%,而NaCl处理6 h和12 h的龙葵素含量分别增加了68.86%和91.42%。因此,20% NaCl处理可有效抑制马铃薯表皮绿变和龙葵素的产生,并且20% NaCl处理对马铃薯发芽也有明显的抑制作用。     

高二氧化碳处理对马铃薯绿变和龙葵素含量的影响

为了研究高二氧化碳处理对马铃薯绿变和龙葵素含量的影响,研究了不同时间高二氧化碳处理后光照贮藏马铃薯表皮a值、叶绿素和龙葵素含量的变化。结果表明,随着贮藏时间的延长马铃薯表皮a值下降,颜色趋于绿色,高二氧化碳处理能够抑制马铃薯表皮a值的降低,贮藏期间HCO2-24处理表皮a值最高;叶绿素含量均有所升高,贮藏到12天,对照叶绿素含量达到17.11 mg/kg,HCO2-12处理含量为7.10 mg/kg,HCO2-48处理含量为4.80 mg/kg,而HCO2-24处理含量为3.45 mg/kg,从试验数据可以看出,高二氧化碳处理能够控制马铃薯绿变,延长货架期;贮藏后龙葵素含量升高,而HCO2-24处理含量有所降低,但差异不显著。     

超低氧处理对采后马铃薯绿变及品质变化的影响

绿变是影响马铃薯采后品质的关键因素。研究了20℃温度、80%~85%相对湿度、24 h荧光灯照射条件下超低氧(ULO,0.3%±0.05%O2,CO20.2%)处理3 d和6 d对经2~4℃贮藏3个月的马铃薯绿变的抑制作用以及对发芽指数、还原糖、淀粉及VC含量等品质指标的影响。结果表明,马铃薯块茎经超低氧3 d和6 d处理,可明显抑制光照引起的马铃薯绿变,并有效抑制其发芽和VC含量的下降,其中超低氧处理6 d的抑制效果显著优于处理3 d,贮藏12 d后,马铃薯的绿变轻微,品质良好。     

羊源A型产气荚膜梭菌α毒素基因截短表达及其间接ELISA方法的建立与应用

基于GenBank登录的产气荚膜梭菌α毒素的氨基酸序列进行抗原决定簇及抗原性的分析,确定优势抗原区(101 aa～334 aa)。设计合成1对引物,以A型产气荚膜梭菌的DNA为模板,应用PCR方法扩增出702 bp大小的基因片段,克隆至表达载体pET32a(+)中进行原核表达。经亲和层析纯化的蛋白,Western blot鉴定相对分子质量约为43 kDa。以纯化的截短α毒素蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法,最适条件：2 mg/L重组蛋白100μL/孔、4℃过夜包被,血清样本1∶50稀释、37℃孵育40 min, HRP标记二抗1∶2 500稀释、37℃孵育40 min,底物37℃显色10 min后终止反应。使用建立的方法对226份临床羊血清进行检测,阳性率为71.68%。结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于羊群疫苗免疫后的抗体监测及流行病学调查,为试剂盒的开发奠定了基础。