禽流感对食品安全的影响

禽流感对食品安全的影响是巨大的,是影响肉食品安全的重要风险因素。论文从禽流感对家禽养殖业发展的影响、通过食品链条对人类健康造成危害、重大食品安全事故影响国际贸易和企业发展三方面论述了禽流感对食品安全的影响。阐明了认清禽流感的病原并掌握正确的防范措施,采取切实可行的对策,依靠实用有效的科学技术,就一定能成功地防止禽流感可能造成的重大食品安全事故,避免经济损失和社会影响,保证国民经济健康地向前发展。     

抗禽流感病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步分析

为制备抗禽流感病毒(AIV)NS1蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位鉴定,本研究以原核表达并纯化的NS1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,制备的D7和D9 2株能够稳定分泌抗NS1蛋白MAb的杂交瘤细胞,亚型鉴定均为IgG1型,轻链均为k链.Western blot鉴定表明,这2株MAbs均能够识别NS1重组蛋白.间接免疫荧光鉴定表明,这2株MAbs均能够识别真核表达的NS1蛋白.利用噬菌体展示技术得到D9对应的短肽WNLNTV,与NS1蛋白aa 182～aa 187基本匹配,提示182WNDNTV187为NS1蛋白的一个线性表位.该结果为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础.     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

禽流感病毒神经氨酸酶基因在重组杆状病毒中的表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计并合成引物。从H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高保真DNA聚合酶扩增NA基因,构建转移载体pFastBacHTA-NA,并与大肠杆菌DH10Bac的Bacmid质粒重组,构建重组转座质粒rBacmid-NA。在脂质体介导下将rBacmid-NA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达NA蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和激光共聚焦检测蛋白。结果表明:表达的NA蛋白分子量约为53 ku,该蛋白能与H5N1亚型AIV血清发生特异性反应,证明NA蛋白表达正确,具有良好的免疫反应性。