猪丁型冠状病毒在悬浮培养猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性分析

旨在分析猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)在悬浮培养的猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性,为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供细胞材料。采用逐步降血清法优化LLC-PK1细胞悬浮培养工艺;利用有限稀释法筛选PDCoV适应性细胞株;利用间接免疫荧光法鉴定PDCoV对LLC-PK1细胞的感染性;分别对PDCoV接种LLC-PK1悬浮细胞的初始密度、MOI、收毒时间、TPCK胰酶浓度等参数进行优化,确定最佳悬浮培养条件。成功筛选出可高效增殖PDCoV的单克隆悬浮细胞株LLC-PK1Sa,且利用其增殖的PDCoV可特异性的感染LLC-PK1细胞;PDCoV按MOI为10^-3接种于密度为2×10⁶ cells·mL^-1的LLC-PK1Sa细胞,当TPCK胰酶终浓度达到7.5 μg·mL^-1时,接毒后48 h收获的病毒液滴度最高。本研究首次实现了PDCoV在LLC-PK1Sa悬浮细胞中的高效增殖,并对悬浮培养条件进行了初步优化,可为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供理论参考。     

BHK-21细胞规模化培养鸡新城疫病毒工艺的研究和初步应用

为了实现鸡新城疫病毒HN2018株(基因Ⅶ型)在乳仓鼠肾(BHK-21)细胞上的无血清规模化培养,本试验采用悬浮培养技术驯化和筛选了1株能够稳定传代的BHK-21-xh悬浮细胞株;使用该细胞以初始密度为100×10⁴个/mL接种摇瓶进行培养,并对摇瓶培养鸡新城疫病毒HN2018株的接毒细胞密度、培养温度、接毒量、收毒时间等工艺参数进行摸索和优化;利用摇瓶优化的病毒培养工艺,在10和100 L生物反应器中逐级放大培养BHK-21-xh悬浮细胞,接种鸡新城疫病毒;采用生物反应器悬浮培养的鸡新城疫病毒HN2018株细胞毒与鸡胚毒分别制备成灭活疫苗,免疫SPF鸡进行免疫效力的比较。结果显示,在摇瓶中培养72 h细胞密度均不低于800×10⁴个/mL,细胞活率均不低于96%;按照BHK-21-xh细胞密度不低于800×10⁴个/mL,病毒感染复数(MOI)为0.216进行接毒,同时添加终浓度为20μg/mL的胰蛋白酶,于35℃温度条件下培养64～72 h收获病毒液,鸡新城疫悬浮培养细胞毒红细胞凝集(HA)效价最高能够达到10log...     

不同产地鱼腥草中4种活性成分分析评价

研究旨在建立一种鲜鱼腥草蒸馏液中4种活性成分4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮的含量测定的气相色谱法,应用该方法测定不同产地鱼腥草的4种活性成分含量。参照鱼腥草注射液质量标准,建立4种活性成分含量测定的前处理和气相色谱检测法,并对其进行方法学验证;应用所建方法对湖北省、四川省、贵州省、广东省广州市4个地区的鲜鱼腥草中活性成分进行测定分析。结果表明,所建立的方法专属性强,4种活性成分在0.1～1.5 mg/mL的范围内,相关系数均大于0.999,线性关系优良,方法重复性试验样品中4种成分平均RSD≤1.2%,中间精密度试验样品中4种成分平均RSD≤1.3%,精密度好,回收率在80%～120%之间,准确度高。测得湖北省、四川省、贵州省的4种成分含量均符合规定,其中以湖北和四川地区含量相对较高。上述研究可为鱼腥草的药材选择、鱼腥草药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的参考依据。