牛超数排卵影响因素分析

高效、稳定的超数排卵方法是获得充足卵源，充分发挥胚胎移植实际应用效果，扩大优良母畜繁殖速度的技术支撑和保障。长期以来，对于牛超数排卵影响因素的研究一直是生殖生物学家关注的热门课题之一。因此本文在查阅大量相关文献资料、总结实验经验和综合分析的基础上，紧密结合胚胎工程研究与应用过程中的实际需要，就环境条件、个体情况和超排处理方法对超排效果的影响因素等关键技术环节进行了概括性的论述，为建立牛超数排卵的科学体系奠定基础。     

TSA对滩羊成纤维细胞作为供体细胞的作用

为探索成纤维细胞作为供体细胞的潜能和TrichostatinA(TSA)处理供体细胞的适合浓度,提高克隆胚胎的发育水平。本研究分别利用100、50、25、10ng·mL-1TSA处理滩羊成纤维细胞,观察细胞形态,统计细胞活率,利用流式分选技术分析处理前后细胞的周期时相,同时通过间接免疫荧光法检测细胞乙酰化水平,并以经过10～50ng·mL-1TSA处理的成纤维细胞作为供体细胞,检测其重构胚发育水平。结果发现,当TSA的浓度达100ng·mL-1时,细胞大量死亡,不同浓度TSA处理细胞24h后,细胞周期被明显抑制在G0/G1期,乙酰化水平明显高于对照组,其中供体细胞经10ng·mL-1TSA处理的克隆胚胎卵裂率和囊胚率明显升高(P0.05,(85.2±3.4)%vs(68.6±6.7)%,(35.6±5.7)%vs(10.4±8.3)%)。结果表明,经10ng·mL-1TSA处理的滩羊成纤维细胞周期同步化明显,乙酰化维持较高水平,重构胚胎发育水平明显提高,适合作为成纤维细胞的处理方法和浓度。     

表观遗传因素对哺乳动物胚胎发育的影响

哺乳动物核移植技术作为发育生物学的重要研究方法,在农业、医药、动物保护等方面具有巨大潜力.核移植的低成功率一直是其发展的瓶颈,而体细胞核在卵母细胞中的重编程效率低下是造成该瓶颈的重要诱因.DNA甲基化作为支配基因正常表达的表观遗传修饰方式,是调节基因组功能的重要手段,在胚胎正常发育过程中具有显著调节基因组功能的作用.本研究论述了DNA甲基化、基因印记、microRNA、X染色体失活等因素对哺乳动物胚胎发育中基因调控的影响.     

不同处理牛卵丘/颗粒细胞作为核供体对克隆胚发育的影响

本研究利用TSA（Trichostatin A）、ROS（Roscovitine）、血清饥饿和接触抑制方法处理牛卵丘/颗粒细胞,检测处理前后细胞乙酰化水平、周期分布及其对重组胚发育能力的影响,为提高核移植效率提供理论基础。分别采用上述方法处理牛卵丘/颗粒细胞,首先对处理的细胞形态及活率进行观察,并利用流式分选技术检测处理细胞的周期分布,再通过间接免疫荧光法检测经上述不同处理前后细胞乙酰化水平变化,最后以上述处理细胞作为核供体构建重组胚,比较重组胚发育水平的不同。试验结果显示,经上述处理的卵丘/颗粒细胞形态良好,活率均保持在94%以上;TSA处理卵丘/颗粒细胞后,其乙酰化水平较对照组和其他处理组明显增加（P〈0.05）,经ROS处理的卵丘/颗粒细胞乙酰化表达水平同样高于对照组（P〈0.05）,但仍低于TSA处理组（P〈0.05）,但经血清饥饿处理的卵丘/颗粒细胞乙酰化水平较对照组明显降低（P〈0.05）;利用TSA处理卵丘/颗粒细胞24 h后,细胞被明显抑制在G0/G1期,且较其他处理组的抑制现象更加明显（P〈0.05）;并且,经TSA处理后的卵丘/颗粒细胞充当供体细胞,其卵裂率和囊胚率较对照组明显增加（P〈0.01,（85.2±3.4）%vs（68.6±6.7）%;（30.2±5.7）%vs（10.4±8.3）%）。经TSA处理的牛卵丘/颗粒细胞,与其他处理组相比,乙酰化水平较高,细胞形态良好,细胞周期被明显抑制在G0/G1期,且获得了较高的卵裂率和囊胚率,作为供体细胞的处理方式较为适合。     

卵母细胞体外成熟的影响因素

随着哺乳动物体外受精、细胞核移植技术的不断深入,人们对成熟卵母细胞以及哺乳动物胚胎需求量日益增加,卵巢内丰富的卵泡资源是胚胎工程迅速发展的基础。本文从卵巢因素、供体、体外培养条件和成熟培养液中添加成分等对卵母细胞IVM的影响进行了分析,为胚胎的体外生产提供理论基础和科研依据。