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为建立简单、经济的重组人β防御素3(HBD3)制备方法,将HBD3序列插入类弹性蛋白(ELP)与△I-CM内含肽融合表达载体,将重组载体转化大肠杆菌,20℃下用IPTG诱导融合蛋白表达,在优化条件下进行相变循环,用内含肽自裂解活性释放目的蛋白,用琼脂扩散和最小抑菌浓度法测定重组HBD3抗菌活性。结果表明:融合蛋白在重组菌中获得可溶性表达,第1轮相变循环的纯度为85.7%,再次相变循化的纯度达93.1%;内含肽裂解温度为28℃,孵育12 h裂解效率达90.3%;重组HBD3回收率达74.8%,产量为0.98 mg·L~(-1),纯度为92.6%,内毒素含量低于0.03 U·mg~(-1)(蛋白),对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抑菌活性。说明基于ELP相变循化和内含肽自裂解的重组蛋白表达与纯化系统可用于重组}tBD3的规模化制备。 相似文献
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为建立一种制备简单、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(ASFV)抗原快速检测方法,利用双表达载体pIRES在293A细胞上表达带有His标签和Flag标签的p30重组蛋白,裂解细胞后,通过免疫共沉淀发现p30重组蛋白以聚合体形式存在,进一步用质谱方法对原核系统表达纯化的p30重组蛋白进行分子量测定,结果证实,ASFV p30能自发形成二聚体。在此基础上,用抗p30的单克隆抗体6H9A10建立了单一单克隆抗体夹心检测p30二聚体的胶体金免疫层析方法,该方法对p30重组抗原最低检测浓度为2.1 ng·mL-1,对PRV、CSFV、PRRSV、PCV-2、PEDV、PPV、SVA等抗原检测结果均为阴性;用该胶体金免疫层析方法检测已知的100份临床样品,其中包含20份ASFV阴性血清、20份ASFV阴性组织、10份ASFV阴性血浆、21份ASFV阳性血清、21份ASFV阳性组织、8份ASFV阳性血浆,结果显示,检测出的48份阴性样品和49份阳性样品与已知结果一致。综上,建立的单个单克隆抗体夹心检测p30的胶体金免疫层析方法具有良好的特异性和敏感性,有望用于ASFV抗原的临床快速检测... 相似文献
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为了获得非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)重组蛋白pK205R、pE183L、pA104R和pB602L,将Ba71V株的K205R、E183L、A104R和B602L基因分别亚克隆进行原核表达载体pET30a(+),构建重组质粒pET-E183L、pET-B602L、pET-K205R和pET-A104R,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。IPTG诱导后,纯化表达的蛋白,并进行Western blotting鉴定,结果4种重组蛋白与预期大小一致,且与ASFV抗体发生特异性反应。为了从表达的4种重组蛋白中筛选最佳诊断抗原,将其分别包被酶标板,间接ELISA检测ASFV阳性血清,发现重组蛋白pK205R、p54和pB602L血清学反应良好;在检测ASFV感染后第13天分离血清时,重组蛋白p54和pK205R效果更佳,这表明p54和pK205R重组蛋白是较好的诊断抗原,可用于ASFV感染后早期或中后期血清学诊断。 相似文献
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概述了欧李在宁夏银川的引种表现,并介绍了其丰产栽培技术,包括整地、栽植、肥水管理、修剪、病虫害防治等内容,以供种植户参考。 相似文献
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为了获得无标签重组抗原用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测,本研究将B602L与类弹性蛋白多肽(ELP)基因进行融合表达,利用简单、经济的相变循环(ITC)纯化ELP-B602L融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,再用ITC回收重组B602L蛋白;用抗体阳性猪血清对重组B602L进行鉴定;以重组B602L蛋白为包被抗原进行ELISA鉴定。结果显示重组大肠杆菌能正确表达ELP-B602L融合蛋白,纯化融合蛋白纯度大于85%;TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签的效率大于90%,回收的重组B602L蛋白纯度大于90%,能与抗体阳性猪血清反应;以重组B602L蛋白为包被抗原建立的ELISA与抗体阳性血清反应为阳性,与抗体阴性血清反应为阴性,OD450值与血清稀释倍数具有线性相关性。 相似文献
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盘尾丝虫ASP1蛋白佐剂活性区不同标签融合表达与佐剂活性比较 总被引:1,自引:0,他引:1
为了探明纯化标签对盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1(activation-associated secreted protein 1,ASP1)佐剂活性的影响,将其佐剂活性区PR-1编码序列分别与类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)、ELK16自聚肽或His标签进行融合表达,用相变循环、离心洗涤和镍亲和层析进行融合蛋白纯化;将ELP与传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2基因片段进行融合表达,用蛋白酶切除ELP标签后与不同标签融合PR-1免疫小鼠,两次免疫后不同时间采血分离血清,采用ELISA检测VP2特异IgG、IgG1和IgG2c滴度,用试剂盒检测免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10浓度。结果显示,ELP-PR1、ELK-PR1、His-PR1和ELP-VP2融合蛋白在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化蛋白纯度大于90%;3种标签融合PR-1均能增强免疫小鼠的抗原特异IgG、IgG1和IgG2应答,并能刺激小鼠产生IFN-γ、TNF-α、IL-6或IL-10细胞因子。在3种PR-1融合蛋白中,ELP-PR1的佐剂活性最强,ELK-PR1与不完全弗氏佐剂相当。本研究探索了不同纯化标签对PR-1免疫佐剂活性的影响,为传染性法氏囊病新型亚单位疫苗佐剂研制提供思路。 相似文献
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为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)接触感染模型,将易感仔猪与PRRSV人工感染仔猪在隔离器中同居饲养,每日观察记录体温变化和临床症状,定期采集血清和粪便样品,用荧光定量RT-PCR检测病毒血症和粪便排毒水平;对病死猪和试验结束迫杀猪进行剖检和肺脏组织病理学检查,并检测各器官病毒载量和组织分布。结果显示:接触感染仔猪出现高热和PRRS症状时间分别较人工接种猪推迟2~3d;第3天起血清检测PRRSV阳性,第10天病毒血症上升至较高水平(108.6拷贝/mL);第5天起粪便检测PRRSV阳性,第7天粪便排毒量上升至较高水平(103.9拷贝/0.1g);3头接触感染仔猪分别于同居后第12天和第13天死亡,较人工接种猪推迟1~2d,病死猪的主要器官病毒载量以及剖检和肺脏显微病理变化与人工接种病死猪相似。这些结果表明,本研究建立的接触感染仔猪模型可用于PRRS疫苗免疫效果评价。 相似文献
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非洲猪瘟病毒p72基因的纳米金探针研究 总被引:1,自引:0,他引:1
对22株发表的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72基因序列进行比较,找出其中的高保守性区域,各设计、合成1条与保守区域互补的5′生物索标记及3′烷巯基修饰短链寡核苷酸探针,并将烷巯基修饰的探针吸附到纳米金颗粒上,制备纳米金标记探针.PCR扩增出的p72基因中的651 bp保守核酸序列,变性后与上述生物素探针及标记纳米金探针进... 相似文献
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为了选择合理的非洲猪瘟病毒(ASFV)重组载体的激发/加强免疫策略,构建表达ASFV CD2v-p30-p54融合抗原的重组伪狂犬病毒rPRV-F1,将其与表达相同融合抗原的重组腺病毒rAd-F1分为rAd-F1/rAd-F1、rAd-F1/rPRV-F1、rPRV-F1/rPRV-F1、rPRV-F1/rAd-F1 4个组合进行猪免疫试验,分别于免疫后不同时间采血并分离血清进行ELISA抗体检测,分离的外周血单个核细胞(PBMC)经ASFV抗原刺激后进行IFN-γ检测。免疫荧光与免疫转印试验结果显示,构建的rPRV-F1能在感染细胞中正确表达F1融合蛋白。所有免疫猪均能检测到抗原特异性抗体,加强免疫后的抗体水平显著升高。在测试的4个免疫方案中,尽管rAd-F1/rAd-F1组合初次免疫后的抗原特异性抗体水平和IFN-γ表达水平最高,但加强免疫后的抗体水平和IFN-γ表达水平最低。与此相反,尽管rPRV-F1/rAd-F1组合初次免疫后的抗体水平和IFN-γ表达水平最低,但加强免疫后的抗体水平和IFN-γ表达水平最高。这些研究结果表明rPRV/rAd是较好的ASFV重组载体疫苗的激发/加强免疫策略。 相似文献