猪星状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种能够快速、简便、灵敏地检测猪星状病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据已报道的猪星状病毒ORF2基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增ORF2基因片段,将测序正确的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪星状病毒荧光定量PCR的标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线特异,灵敏度可达1×101拷贝,是普通PCR检测方法的100倍,特异性和重复性较好。本次建立的猪星状病毒荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、敏感等优点,有重要的实用价值。     

牛溶血性巴氏杆菌的分离鉴定

呼和浩特市某肉牛养殖场犊牛发生了以体温升高、呼吸困难、咳嗽及死亡为主的疾病.从该牛场发病死亡的犊牛采集病料,采用病料涂片镜检、细菌分离培养、生化鉴定及动物试验的方法,对导致该牛场犊牛发病死亡的病原进行了分离鉴定,结果从该牛场患病死亡犊牛的心、肝、肺中均分离出溶血性巴氏杆菌,从而确诊该牛场此次犊牛发病为牛溶血性巴氏杆菌病.     

7种不同种属来源细胞的PCR检测方法与应用

为确定实验室常用细胞来源的可靠性,以及培养过程中是否存在不同种属间细胞的交叉污染现象,本研究针对不同物种的细胞色素b基因进行引物设计并优化,建立PCR扩增体系,对实验室常用的7种不同种属来源的细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)进行细胞种属鉴定。试验结果表明:该PCR检测方法特异性较好,操作简便,最低可检测到0.01 ng/μL的DNA含量。结论:本研究所建立的方法能够很好的对7种不同种属的细胞进行鉴别,对细胞培养过程中的质量把控具有重要的指导意义。     

牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感MDBK细胞克隆与鉴定

研究采用有限稀释法将MDBK细胞进行克隆,并放大培养。将2种生物型(致细胞病变型和非致细胞病变型)的牛病毒性腹泻/黏膜病毒混匀,接种克隆的MDBK细胞并收获毒液。采用间接免疫荧光技术检测病毒含量,筛选BVDV敏感细胞。试验成功获得4株单克隆细胞,其中C3株对病毒高度敏感且产毒稳定,确定为BVDV敏感细胞株。     

猪人工授精技术在我国北方地区的应用

猪人工授精技术是当前养猪业生产中的一个重要环节,在我国北方地区,尤其是内蒙古地区,猪人工授精技术还没有普及。为了适应养猪业发展步伐,在内蒙古西部地区的养猪场建立了采精站,针对北方冬季寒冷的特点,探索在采精室安置暖气和空调,授精时用护腕包裹授精瓶等前提下应用猪人工授精技术,达到促进我国北方地区养猪业健康良性快速发展的目的。     

猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞的克隆和鉴别

本研究采用有限稀释法将ST细胞进行克隆,将获取的单克隆细胞放大培养后接种猪瘟兔化弱毒株(C株),通过实时荧光定量RT-PCR技术定量检测毒液中病毒含量,筛选对猪瘟兔化弱毒株敏感的细胞株。试验结果获得D3株、C4株、C8株、D5株、E10株、E11株、F9株和H9株共8株ST单克隆细胞。其中,C4株和E11株细胞对C株高度易感,收获毒液RNA拷贝数能够维持在106 copies/mL,并且高峰期毒液拷贝数可达107 copies/mL。     

犬细小病毒上海分离株全基因的克隆及进化树分析

为研究上海地区犬感染细小病毒（Canine parvovirus,Cpv）的基因特点和基因型,参考GenBank上细小病毒3个基因型的全基因设计6对扩增引物进行PCR,分段扩增出目标片段,克隆于T载体上,测定序列并拼接,用MEGA软件、NJ法构建进化树。结果显示,犬细小病毒全基因为4758bp,命名为CPV-SH．提交到GenBank上的序列号为FJ792845,与GenBank中4神基因型爽细小病毒的VP2基因核苷酸序列同源性比较发现,CPV-SH克隆与2a亚型犬细小病毒核苷酸同源性为最高99．7％,与2型、2b亚型。2e亚型的同源性分别为98．8％、99．5％．99．5％。CPV-SH属于2a亚型犬细小病毒,与国内北京分离株CPV／BJ082亲缘关系最近,同源性为99．9％。