环境DNA方法在水生动物疫病监测方面的应用

环境DNA(environmental DNA,eDNA)方法是一种从环境样品（土壤、沉积物、水体和生物膜等）中直接提取DNA后,利用分子生物学及测序技术开展的定性或定量分析方法,具有成本低、效率高、采样无损伤性等优点,已被广泛用于生态系统的物种多样性研究、资源生物量检测以及濒危种和入侵种检测。近年来,该技术在水生动物病原检测方面的应用也得到快速发展,尤其是针对高价值和稀有动物的疫病监测具有较强的优势。本文对eDNA在水生动物疫病监测中的应用研究现状进行了综述,指出了虽然eDNA方法仍存在一定局限性,但可适用于不同情形下的水生动物采样,有助于增强水生动物疫病主动监测。本文为深入开展eDNA方法在水生动物疫病监测方面的应用提供了参考。     

FTA卡保存对虾传染性皮下和造血组织坏死病毒DNA洗脱方法的优化

传染性皮下和造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV)是危害虾类健康养殖的重要病原,为寻找一种快捷保存及分离IHHNV DNA的方法,为后续研究提供完整的核酸材料,选用FTA (flinders technology associates)卡为保存介质,以FTA纯化试剂、TE (Tris-EDTA)缓冲液及去离子水为基础洗脱液,设计7种FTA卡黏附DNA洗脱方法,通过荧光定量PCR检测方法检验不同核酸洗脱分离效果及最低的点膜核酸量。结果显示,于4 mm2的FTA卡上,点样体积为2.5 μL,用洗脱液作为模板时,最低点膜核酸浓度需要1.47×104 copies/μL以上,可获得最佳的检测灵敏度和100%检出率的洗膜方法为50 μL TE缓冲液于95 ℃下浸洗5 min;用膜片做模板,点膜核酸浓度需要1.82×103 copies/μL以上,室温(20~25 ℃)条件下,用FTA纯化试剂洗脱3次,再用TE缓冲液洗脱2次,洗脱时间均为5 min,可获得最佳的检测灵敏度和100%的准确度。以FTA卡保存对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、虾十足目虹彩病毒1 (Decapod iridescent virus 1, DIV1)、偷死野田村病毒(covert mortality noda virus, CMNV)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND)核酸,测试所建洗脱方法的效果,证实了该方法对其他虾类病原核酸的洗脱具有通用性。该研究给出了FTA卡保存和洗脱IHHNV DNA的适用性方案,为野外对虾样品采集、病毒核酸样品跨区域传递的保存和运输条件提供了科学数据。