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猪囊尾蚴dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】克隆、表达猪囊尾蚴dUTPase基因并分析其酶学活性。【方法】通过RT-PCR的方法克隆猪囊尾蚴dUTPase基因,将其与pET载体连接并在原核系统中高效表达;表达产物经Ni柱纯化后进行酶学活性测定。【结果】序列分析表明猪囊尾蚴dUTPase基因与六钩蚴的dUTPase基因核苷酸同源性为100%,而且其氨基酸序列中同样存在5个保守基序。SDS-PAGE显示在21kD附近出现与目的蛋白大小相符的特异条带,表达产物经纯化后dUTPase的含量为2.863mg·mL-1。酶学活性试验证实重组dUTPase能特异性降解dUTP,同时EDTA可以抑制dUTPase的活性;而Mg2+可以增强猪囊尾蚴dUTPase的活性。【结论】成功克隆表达了猪囊尾蚴dUTPase基因并鉴定了它的酶学活性,为进一步研究dUTPase在猪囊尾蚴中的生物学功能奠定了基础,同时也为抗猪囊尾蚴病的药物设计和开发提供了研究基础。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答 总被引:1,自引:0,他引:1
本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4~1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。 相似文献
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将90只海蓝褐雏鸡随机分为对照组、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)一次感染组和毒害艾美耳球虫两次感染组,应用二重PCR方法,通过对肠道组织热休克蛋白-90 (HSP-90) mRNA表达的检测,较全面系统地研究了毒害艾美耳球虫感染对雏鸡肠道组织HSP-90 mRNA表达的影响。结果发现,14日龄雏鸡经口第一次感染毒害艾美耳球虫后0~14 d,其肠道组织HSP-90 mRNA表达虽然不同程度的低于对照雏鸡,但总体呈上升趋势;上述雏鸡于28日龄时再次攻击性感染毒害艾美耳球虫,其十二指肠、空肠和回肠HSP-90 mRNA表达均呈先下降后上升,而盲肠HSP-90 mRNA表达始终呈下降趋势。28日龄雏鸡一次性大剂量感染毒害艾美耳球虫后,其十二指肠、空肠、盲肠HSP-90 mRNA表达均下降,而回肠HSP-90 mRNA表达先下降后上升。结果表明毒害艾美耳球虫感染雏鸡初期,肠道组织HSP-90 mRNA表达受到一定抑制,其表达量与肠道组织细胞损伤程度密切相关。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业发展的传染病,为了PRRSV GP3-GP5(N-糖基化蛋白)-M(膜蛋白)融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性,本研究利用脂质体法将构建好的真核重组表达质粒pcDNA3.1-ORF3-ORF5-ORF6转染猪肾细胞(PK-15细胞),经G418(600 μg/mL)筛选(72 h)获得稳定表达PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白的稳定细胞株.以RT-PCR分析目的基因转录;间接免疫荧光检测融合蛋白表达;Western blot和小鼠(Mus musculus)免疫试验检测融合蛋白免疫原性.结果表明,RT-PCR检测到3种目的基因的转录;间接免疫荧光检测到融合蛋白得以表达,Western blot检测到融合蛋白可与阳性猪血清发生特异性反应.小鼠免疫试验二免后S/P=样本/阳性对照的比率,达到1.80(S/P>0.4为阳性),并且至少可以持续1个月.本研究成功实现了PRRSV GP3-GP5-M 融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达,证实PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白具有良好的免疫原性,为PRRSV 多基因核酸疫苗研制提供了基础资料. 相似文献
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