结核分支杆菌Rv2031c慢病毒载体的构建及其对RAW264.7细胞凋亡的影响

研究结核分支杆菌Rv2031c基因对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分支杆菌Rv2031c的序列设计引物,以结核分支杆菌国际标准株H37Rv株灭活的菌液上清液为模版,扩增Rv2031c基因;克隆至慢病毒表达载体plex-EGFP中,经酶切和测序鉴定后,获得plex-Rv2031c-EGFP重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与辅助质粒共转染至293T细胞中,转染48h后收集慢病毒,并侵染RAW264.7细胞;侵染48h时收集细胞,用流式细胞术检测各试验组巨噬细胞的凋亡率;提取细胞总RNA并反转录成cDNA,PCR检测Rv2031c基因在细胞中的表达情况;同时,使用细胞裂解液提取细胞总蛋白,Western blot检测Rv2031c蛋白表达水平。结果表明,成功构建了Rv2031c的慢病毒表达载体plex-Rv2031c-EGFP;构建了过表达Rv2031c的慢病毒Rv2031c-lv;感染Rv2031c-lv的RAW264.7细胞的凋亡率为41.8%,而对照组EGFP-lv感染的RAW264.7细胞其凋亡率为30.0%;PCR结果表明Rv2031c在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达;Western blot结果显示Rv2031c蛋白在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达。该研究成功构建了结核分支杆菌Rv2031c的慢病毒表达载体并验证了其对RAW264.7细胞凋亡的影响,为结核分支杆菌在机体内潜伏期感染的药物研究奠定了基础。     

慢病毒介导牛pre-miR-29b表达的Balb/c小鼠模型建立研究

为了通过慢病毒感染的方法建立pre-miR-29b表达的Balb/c小鼠模型,从而研究miR-29b在动物模型体内过表达对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染和复制的影响,试验根据miRBase数据库中牛miR-29b前体pre-miR-29b序列设计引物,以MDBK细胞全基因组DNA为模板,PCR扩增pre-miR-29b基因,并克隆至空质粒pLL3.7中;共同转染pLL3.7-pre-miR-29b及慢病毒包装辅助质粒(pRSV-Rev、pCMV-VSVG和pMDLg/pRRE)至HEK-293T细胞中,于48,72小时时收集病毒液,浓缩后接种至HEK-293T细胞中进行慢病毒效价测定。将6只Balb/c小鼠平均分成2组,即空质粒pLL3.7感染组和慢病毒pLL3.7-pre-miR-29b感染组,每只小鼠尾静脉注射5.0×10~7 infection units(IU)/mL病毒液,于注射后96小时时处死小鼠,采集肝脏、脾脏、肾脏等器官,提取总miRNA,并反转录成cDNA,使用TaqMan荧光定量RT-PCR法检测miR-29b在小鼠不同器官中的表达情况。结果表明:试验成功扩增得到牛pre-miR-29b并构建出pLL3.7-pre-miR-29b;成功包装pLL3.7-pre-miR-29b慢病毒,其效价为5.8×10~8 IU/mL;经尾静脉注射慢病毒后,在慢病毒pLL3.7-pre-miR-29b感染的小鼠不同器官中均有较高水平的miR-29b表达。说明试验成功建立了慢病毒介导牛pre-miR-29b表达的Balb/c小鼠模型。     

miR-193a在MDBK细胞中诱导细胞凋亡的研究

本试验旨在研究miR-193a在致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(cp BVDV)感染MDBK细胞过程中诱导细胞凋亡的分子机制。试验利用TargetScan和Microcosm Targets等生物信息学在线软件预测凋亡相关的miR-193a靶基因Bax,并利用双荧光素酶报告基因系统验证miR-193a的靶基因;用过表达miR-193a的慢病毒pre-miR-193a-lv和抑制miR-193a表达的慢病毒pre-miR-193a-inhibitor-lv分别侵染MDBK细胞,48 h后收集细胞,然后用实时荧光定量PCR、Western blotting和流式细胞仪检测凋亡通路中Bax的表达水平及MDBK细胞凋亡率。结果预测并验证了miR-193a的靶基因为Bax;双荧光素酶报告基因分析结果显示miR-193a能直接结合到Bax 3'UTR区域中的miRNA反应位点,并极显著下调Bax的表达水平(P<0.01);流式细胞仪检测凋亡率结果显示,感染pre-miR-193a-lv慢病毒的MDBK细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。结果表明miR-193a能直接靶向凋亡通路中Bax基因,从而促进凋亡的发生。     

结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对RAW264.7细胞凋亡的影响

试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。