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为探讨橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus)黑色素细胞和黄色素细胞的分离、培养与鉴定方法,观察鱼类色素细胞生长特征,本研究以橘色双冠丽鱼的尾鳍、鳞片、皮肤组织为材料,在25℃~28℃条件下,分别在胰蛋白酶溶液和胶原酶溶液中消化6 h和12 h,可有效分离出色素细胞团,细胞悬液经气孔尼龙网过滤后,于35%-45%-55% Percoll试剂中梯度分离和收集黄色素细胞和黑色素细胞。采用K-SFM培养基进行细胞原代培养和细胞纯化,抑制成纤维细胞和角朊细胞的生长,用十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)、双抗、bFGF的DMEM培养基进行色素细胞传代培养;运用巴染色和透射电镜观察细胞形态,并用分子标记技术进行细胞鉴定。结果显示,细胞分离时,黑色素细胞位于Percoll试剂45%和35%浓度层之间,黄色素细胞位于Percoll试剂35%浓度层上,2种色素细胞均凝聚成絮状。透射电子显微镜观察发现,黑色素细胞内部含大量黑色素小体,而黄色素细胞内部含喋呤体和类胡萝卜素囊泡;黑色素细胞左旋多巴(L-DOPA)染色呈阳性;取第10代色素细胞进行体色相关基因黑皮素1受体(melanocortin receptor 1, MC1R)、酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)和牛内皮素受体B(endothelin receptor B, EDNRB) PCR检测,显示基因扩增条带特异性强,表明获得的2种色素细胞具有良好的生物学活性。本研究建立了橘色双冠丽鱼黄色素细胞和黑色素细胞的分离培养与鉴定方法,为进一步开展鱼类体色细胞分化和体色形成的分子机理研究提供了细胞模型。 相似文献
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为了解小眼畸形相关转录因子mitf基因在鱼类早期体色褪黑过程中的调控作用,本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus) mitf基因cDNA序列全长,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测其在橘色双冠丽鱼胚胎不同发育时期、体色褪黑不同时期和各个组织中的表达规律。获得mitf基因2个亚型,其中,mitf1的cDNA全长为1816 bp,包括5′非编码区(UTR) 158 bp、3′UTR 428 bp、开放阅读框(ORF) 1230 bp,共编码409个氨基酸;mitf2的cDNA全长为1638 bp,包括5´UTR 160 bp、3´UTR 428 bp和ORF 1050 bp,共编码349个氨基酸。同源性和系统进化分析显示,mitf1和mitf2聚在一小支,与慈鲷科(Cichlidae)鱼类同源性最高,与哺乳类动物同源性较低。qRT-PCR结果显示,在成鱼各个组织中,mitf1和mitf2均有不同程度表达,其中,眼部表达量最高且显著高于其他组织(P<0.05),肌肉、脑和肾脏也有较高表达;mitf1和mitf2在胚胎各个发育时期均有表达,在受精卵时期表达量最高,显著高于其他胚胎期;随着橘色双冠丽鱼体色由黑色过渡到橘黄色,mitf1和mitf2在鱼皮肤、鳞片、尾鳍中的表达均呈逐渐下降的趋势,表明mitf基因表达与鱼体色由黑到黄转变的表型间存在关联性,推测与鱼体色发育阶段色素细胞的分化和分布比例的动态变化相关。本研究通过了解鱼类体色发育和变异的分子基础,可为鱼类色素细胞发育和体色人工改良积累资料。 相似文献
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橘色双冠丽鱼TYR基因的克隆及其发育时序和组织表达分析 总被引:1,自引:0,他引:1
酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是动物体内黑色素合成信号通路中起关键性作用的限速酶,黑色素生成的速度和种类取决于TYR基因的表达量和活性水平.为了解色素相关基因与体色变化的关系,采用cDNA末端快速克隆技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus) TYR基因cDNA全序列,并利用qRT-PCR分析了橘色双冠丽鱼体色变化不同时期和不同组织中TYR基因的表达差异.实验获得cDNA全长序列2 683 bp,其中阅读框1 620bp,编码540个氨基酸,5'UTR区246 bp,3'UTR区817 bp.氨基酸序列和系统发育分析表明,相比与脊椎动物间的保守性,TYR蛋白序列在鱼类间的保守性更高.qRT-PCR结果表明,TYR基因在胚胎各期均有表达,受精期表达量最低,血液循环期开始急速上升;在“黑色-灰色-亮黄色”三个典型体色褪黑过程中,各组织TYR基因表达量均在黑色期呈现最高值,显著高于灰色和亮黄色期,灰色到亮黄色时期鳞片和尾鳍的TYR基因表达量逐渐降低,但差异不显著(P>0.05),而皮肤组织的TYR基因表达量在三个体色褪黑期均显著降低(P<0.05);亮黄色时期,TYR基因在心、肾、脑、鳔、性腺、尾鳍和眼等组织均有表达,其中眼部表达量最高,其次是鳔和尾鳍,皮肤和性腺表达量最低.橘色双冠丽鱼TYR基因在三个典型体色褪黑期表达逐渐降低,可能与红色素细胞和黄色素细胞逐渐增多以及黑色素细胞数量和分布比例发生变化相关.本研究通过了解体色变异的分子基础,为鱼类体色遗传和体色改良研究积累资料. 相似文献
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为探究黑素皮质素受体1基因(MC1R)在橘色双冠丽鱼胚胎发育和体色形成过程中的表达定位及功能,本研究首先制备了MC1R基因的RNA正反义探针,T7方向转录的正义RNA探针质量浓度为447.529 ng/μL,SP6方向转录的反义RNA探针质量浓度为342.698 ng/μL。经10~20倍稀释后的探针用于原位杂交,MC1R基因探针表达定位显示,随橘色双冠丽鱼胚胎的发育杂交信号总体呈逐渐减弱趋势,原肠期和视泡期其卵黄和胚体侧卧部分有杂交信号分布;出膜期其脊柱、卵黄囊及其内容物和色素细胞内出现杂交信号;出膜期第1天,卵黄表面有信号分布。总体来看,杂交信号在脊索、卵黄囊、卵黄囊内容物质及色素细胞有特异表达,而以正义探针作为阴性对照组在5个胚胎阶段均无任何信号,杂交信号显现的MC1R表达定位说明其在橘色双冠丽鱼色素细胞的分化、迁移中起到重要调控作用,也与神经、营养、免疫功能相关,初步建立了鱼类体色相关基因功能和定位研究的整胚原位杂交方法。 相似文献
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利用分子标记辅助家系选育进行红鳍东方鲀生长性状的遗传评估,由红鳍东方鲀基础群体中选择性腺发育良好的雌雄亲本各11尾建立全同胞家系11个,每个全同胞家系随机采集10尾个体组建全同胞家系群体,从混合培育的家系中选择相对较大的个体400尾组建混合选育群体。在红鳍东方鲀遗传连锁图谱上挑选44个均匀分布于22个连锁群上的微卫星DNA标记,每个连锁群有2个标记。全同胞家系群体的遗传分析结果显示,10个高亲本排除概率微卫星标记的Excl(1)和Excl(2)为0.58~0.662和0.736~0.797,14个低亲本排除概率标记的Excl(1)和Excl(2)为0.054~0.43和0.177~0.608,剩余20个中等亲本排除概率标记的Excl(1)和Excl(2)为0.467~0.575和0.641~0.732。利用拥有高亲本排除概率的微卫星DNA标记进行混合选育群体的亲权鉴定,结果显示:不同父母本繁殖产生的子代数量存在明显差异,父本M2和母本F4产生了124个子代,占子代个体总数的32.89%。根据亲权鉴定结果建立的系谱估计主要生长性状的遗传参数,不同日龄的体质量和体长遗传力估计值为0.17~0.21和0.15~0.18。研究表明,利用具有高亲本排除概率的微卫星DNA标记能够有效建立红鳍东方鲀系谱,进行生长性状的遗传参数估计,分子标记辅助家系选育可以作为红鳍东方鲀目标性状遗传改良的新方法。 相似文献
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为探究双须骨舌鱼抗缪勒氏管激素基因amh的作用和表达模式,本研究通过RACE技术克隆了双须骨舌鱼amh基因全长c DNA序列,发现存在amh1、amh2两个亚型(Gen Bank登录号KU378662、KU378663)。序列分析结果显示,双须骨舌鱼amh1基因的c DNA全长2277 bp,编码623个氨基酸,amh2基因c DNA全长2181 bp,编码355个氨基酸。同源性分析显示,amh基因保守性较低,双须骨舌鱼与同科的美丽硬仆骨舌鱼相似度最高,为85.64%,与不同科鱼类的相似度均低于42%。系统进化分析显示,该基因与骨舌鱼目聚为一支,与鲱形目、鲤形目等较低等的硬骨鱼类亲缘关系较近,与双须骨舌鱼进化地位相符。用荧光定量PCR检测的结果显示,amh基因在双须骨舌鱼不同组织中均有表达,其中amh1亚型在精巢中表达量最高,且明显高于卵巢和其他组织;amh2亚型也在精巢中表达量最高,且明显高于其他组织,但远远低于amh1在精巢中的表达。构建了原核表达载体p ColdⅠ-amh1和p ColdⅠ-amh2并在大肠杆菌中成功诱导出大小分别为68和48 ku的融合蛋白,为进一步研究amh在双须骨舌鱼体内的生物功能奠定了基础。 相似文献
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用含雄性激素甲基睾酮(MT)的饲料饲喂经产雌性斑马鱼(Danio rerio)来探讨外源激素对其性腺发育的影响。通过投饲含0、30、60、120、240和400 mg.kg-1 MT的饲料30 d后,石蜡切片观察斑马鱼卵巢的发育情况。结果表明,随着MT剂量的增加,斑马鱼性腺的发育受到抑制,卵巢结构变化明显。30 mg.kg-1剂量组的成熟系数有明显的降低,至400 mg.kg-1剂量组,成熟系数仅为对照组的1/6;同时外源雄性激素严重影响或抑制了卵巢的进一步发育,较低剂量组性腺发育停滞在Ⅲ时相左右,较高剂量组的性腺明显的退化,至400 mg.kg-1剂量组,卵巢已呈明显的萎缩状态,卵母细胞几乎不可见;卵母细胞在甲基睾酮作用下的退化过程为:抑制卵母细胞发育—细胞核结构变化—累及细胞器—形成凋亡小体、破坏细胞膜结构—凋亡小体逸散、细胞固缩—崩解。结果显示外源雄性激素对雌性斑马鱼的性腺发育影响明显,较高剂量时可导致外源激素的阉割作用。 相似文献
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为科学评价布氏罗非鱼(Tilapia buttikoferi)的营养价值,采用常规方法检测布氏罗非鱼肌肉的营养成分,并与同科经济鱼类和常见的优质淡水鱼类进行比较。结果表明:布氏罗非鱼肌肉中的水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分分别为80.43%、18.63%、0.50%和1.28%;在肌肉(干样)中共测得16种氨基酸,总含量为干质量的82.03%,其中包含7种人体必需氨基酸(EAA),占氨基酸总量(TAA)的40.70%;必需氨基酸指数(EAAI)为73.43%,符合FAO/WHO所规定的人体必需氨基酸的均衡模式;限制性氨基酸为Met+Cys和Val;特征性鲜味氨基酸(FAA)含量为32.13%;不饱和脂肪酸共10种,总量为65.09%,其中油酸和亚油酸分别为28.18%和17.09%,并且含有丰富的DHA和鱼油中相对缺乏的DPA,含量分别为3.32%和2.78%。综合分析,布氏罗非鱼营养丰富,具有优良的食用价值。 相似文献