随机突变对扩展青霉脂肪酶最适作用温度的改善

利用error-prone PCR和staggered extension process(StEP)相结合的方法对扩展青霉脂肪酶(PEL)进行定向进化,构建含有随机突变基因的重组质粒pPIC3.5K-lip-mutantx,电转化引入毕赤酵母GS115中,进行异源表达。高通量筛选获得一株最适作用温度比野生型提高了5℃的突变株。15%的SDS-PAGE表明突变体分子量与野生型一致,约为28kDa。基因测序结果表明,突变体第270位丙氨酸变为苏氨酸,后者是氢键的供体,能形成具有稳定空间结构的氢键,使酶结构更加稳定,在高温下更适于与底物结合。     

易错PCR对扩展青霉脂肪酶基因PEL的定向进化

以带有野生型扩展青霉碱性脂肪酶eDNA全长的载体psk—lip07为模板,利用易错PCR技术以及高通量筛选,最终获得了一株最佳突变体CS—pPIC3．5K—lip07-ER04,其最适作用温度比野生型提高10℃,酶活提高了约22％,热稳定性Tm值也提高了3．28％。基因测序结果表明,脂肪酶（PEL）第82位的Lys突变成Arg,第241位的Glu突变成Pro。     

罗伦隐球酵母B40脂肪酶的分离纯化及N端测序

文章介绍了罗伦隐球酵母B40所产脂肪酶的分离纯化过程,摸索了分离纯化过程中盐析的最佳盐浓度和作用时间,并对离子交换填料进行了选择,确定了纯化效果好的填料及其缓冲体系的pH,同时也对该酶N端序列进行了测定。结果表明,在4℃,65%硫酸铵饱和度的条件下沉淀6h能获得蛋白量较大、活性较高的目的蛋白。将样品过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱,缓冲体系为pH9.020mol·L-1Tris-HCl溶液中进一步洗脱后进行超滤浓缩、纯化得到单一脂肪酶,该脂肪酶的N端蛋白序列为:D-F-G-P-I-T-I-Y-T-P-P-A。