鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与原核表达

参照鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)的基因组序列设计了1对VP3基因特异性扩增引物,通过RT-PCR方法扩增获得了DHAV-1a结构蛋白VP3基因,将纯化的VP3基因与pEASYTM-Blunt Zero Cloning Vector连接,构建DHAV-1aVP3基因克隆重组质粒,然后将VP3基因片段插入pET-32a(+)表达载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。以1.0mmol·L-1 IPTG于37℃诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析表明VP3基因于大肠杆菌中成功表达,其分子量为47kDa,且表达的VP3蛋白能够与Anti-His Mouse mAb发生特异性反应,具有良好的生物活性,为进一步研究DHAV-1aVP3蛋白功能和以VP3蛋白为抗原研制DHAV-1a诊断试剂盒奠定基础。     

中国福建地区H5Nx水禽流感病毒Clade 2.3.4.4分支分子特性分析

为了明确中国福建地区HA基因序列遗传进化关系及氨基酸变异特征,本研究对福建省近5年分离的8株H5N8和H5N6亚型病毒进行HA基因序列测定及遗传进化分析,并通过同源序列比对、同源建模、空间三维结构比对方法对HA蛋白抗原进化、受体结合特性、氨基酸关键位点进行分析。研究结果表明,分离得到的毒株HA基因属于Clade 2.3.4.4分支,HA氨基酸序列裂解位点含有多个连续碱性氨基酸,具备高致病性禽流感特征。HA受体结合位点分析表明,福建省分离的这8株病毒受体结合位点相对保守,仅第193和227位点有变异,具有典型的禽源受体结合特性。本研究丰富了我国福建省禽流感病毒的分子流行病学信息,为福建省禽流感的预警及科学防控提供了依据。     

鹅细小病毒于番鸭成纤维细胞上的适应性研究

为进一步了解鹅细小病毒（GPV）在番鸭成纤维细胞（MDEF）上的适应性及病毒增殖情况,将GPV在MDEF上连续传12代培养,通过PCR、免疫荧光、流式细胞等方法分析其生物学特性。PCR检测结果显示,扩增到大小为734bp的非结构蛋白基因片段,将10倍梯度稀释的病毒悬液接种细胞培养65h后,10-6倍接种的细胞仍能检测到病毒核酸。免疫荧光检测显示,兔抗GPV阳性血清能对染毒的病灶产生特异性荧光染色。流式细胞试验结果进一步证实,GPV在MDEF上增殖速度比较慢,病毒的感染会造成MDEF的早期凋亡。说明该GPV株感染MDEF后虽未产生细胞病变,但病毒能在MDEF中增殖,为GPV开展细胞依赖性相关研究奠定基础。     

坦布苏病毒鸡源分离株全基因组及遗传变异分析

为了解引起鸡产蛋骤降的坦布苏病毒全基因组分子特征,本试验运用RT-PCR技术克隆测定了2株坦布苏病毒鸡源分离株全基因组序列,其基因组为10 990nt,包含1个10 278nt的开放阅读框架,与GenBank数据库中登录的坦布苏病毒参考株一致,与2010年以来的坦布苏病毒毒株核苷酸及推导氨基酸同源性均在98%以上,与2010年前的坦布苏病毒核苷酸和氨基酸序列同源性仅分别为88%和96%左右。基于坦布苏病毒全基因组序列的分子系统进化分析,发现2株鸡源坦布苏病毒与2010年以来分离的各种禽源坦布苏病毒株均处于同一大的进化分支,且相互间的遗传距离均小于2%。以上研究结果表明,坦布苏病毒鸡源分离株与其他禽源病毒分离株的基因组差异不明显,各分离株亲缘关系非常近。     

禽源多杀性巴氏杆菌耐药性分析及氟苯尼考耐药基因floR分布

为了解禽源多杀性巴氏杆菌的药物敏感性及氟苯尼考的耐药基因的分布特征,采用琼脂二倍稀释法,对分离自福建、广东和江西等南方数省部分地区113株禽源多杀性巴氏杆菌进行9种抗生素的耐药性分析,并应用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR的分布情况。结果显示:上述菌株对四环素表现高水平耐药,耐药率为65.49%(74/113);对链霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、氟苯尼考、卡那霉素与恩诺沙星表现中等水平耐药,耐药率分别是43.36%(49/113)、39.82%(45/113)、27.43%(31/113)、25.66%(29/113)与24.78%(28/113);对氨苄西林、头孢噻呋与头孢克洛较为敏感,耐药率分别为4.42%(5/113),2.65%(3/113)与1.77%(2/113);其中52.21%(59/113)菌株能耐受3类及3类以上的抗菌药物;氟苯尼考耐药基因floR的检出率为64.04%(72/113),且所有氟苯尼考耐药菌株均含有floR基因。结论:113株禽源多杀性巴氏杆菌存在多重耐药现象,且floR耐药基因较为流行。本研究结果为上述地区针对禽源多杀性巴氏杆菌临床用药提供科学依据。     

鸽圆环病毒福建株全基因组序列分析

运用PCR技术从福建省某地发病信鸽组织中获得鸽圆环病毒（Pigeon circovirus,PICV）福建株（简称fj1株）全基因组序列,并对鸽圆环病毒福建株基因组核苷酸组成、结构及其遗传进行分析。结果表明,所获fj1株全基因大小2037 nt,包含有2个主要的开放阅读框（open reading frame,ORF）：ORF-V1（41～994nt）编码复制相关结构蛋白（the replicated-associated protein,Rep）,ORF-C1（1987～1166nt）编码核衣壳蛋白（the putative capsid protein,Cap）;在V1和C1的5＇端之间存在一个与圆环病毒滚环复制有关的高度保守的环状发夹结构。fj1株与GenBank登录所有鸽圆环病毒核苷酸同源性在84.5%～93.8%之间,与中国浙江鸽圆环病毒分离株zj1和zj2核苷酸同源性分别为88.7%和88.9%。从遗传进化上看,中国3株鸽圆环病毒均处在Cap蛋白起始密码子＂ATG＂分支,但分居不同亚群。     

鸭巴泰病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸭巴泰病毒(Batai virus,BATV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,研究根据鸭BATV非结构蛋白(NSs)基因特征,设计引物,经条件优化后建立检测BATV感染的qRT-PCR方法。用建立的qRT-PCR方法对临床72份疑似BATV感染的病料进行检测,并对阳性样品进行病毒分离,评价两种方法的符合率。结果表明,当病毒NS基因含量为3.59×10~2~3.59×10~7拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.9994,扩增效率为98%。最低检测限为3.59×10~2拷贝/μL;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(81.60±0.16)℃,对鸭源常见病毒(如鸭甲肝病毒、禽坦布苏病毒、禽Ⅰ型副黏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、新型鸭呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒)检测均为阴性,组内变异系数和组间变异系数分别为0.49%~1.99%和0.58%~2.18%。临床送检的72份病料SYBRⅠ实时荧光定量PCR方法的阳性率为4.17%(3/72),并分离到2株鸭源BATV,2种方法的阳性符合率为66.67%(2/3)。建立的基于SYBRⅠ检测BATV的qRT-PCR方法、特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于BATV的分子流行病学研究。     

半番鸭呼肠孤病毒单克隆抗体的制备

禽呼肠孤病毒（avian reovirus）在各种禽类中普遍存在,主要感染鸡,造成鸡的病毒性关节炎。番鸭的呼肠孤病毒感染,早在1950年南非就有记载,1972年法国首次从番鸭中分离到病毒。近几年来,我国闽、浙等番鸭饲养地区相继发生了一种以肝、脾、胰腺表面出现白色坏死点为特征的传染病,发病率和死亡率均较高。2001年,吴宝成等经病原分离鉴定,确定该病是由禽呼肠孤病毒引起的。其后,多位研究者分别从临床感染发病的半番鸭、鹅中分离到禽呼肠孤病毒。     

番鸭O_(13)大肠杆菌和2型鸭疫里默氏菌混合感染的诊断

致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer)是养鸭生产中最为常见的2种致病性细菌，它们在临床上多以原发或继发于其它疾病出现．有时则表现为二者的混合感染，对养鸭业的危害较大。对于禽类，致病性大肠埃希氏菌的血清型众多，鸭疫里默氏菌也存在多种血清型，二者的血清型之间存在交叉保护，     

鸭流感的临床病型

禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒 (Avian Influenza Virus,AIV)引起禽类的一种疾病综合征,鸡、火鸡以及鸭、鹅、鹌鹑、海鸥等家禽、水禽、野鸟均可感染,引起禽类出现高度死亡、产蛋量下降、严重的呼吸道病、系统综合征或隐性感染等多种病型,对养禽业可造成巨大经济损失。目前AI已成为威胁全球养禽业的头号大敌。众所周知A型流感病毒最复杂的生态系统在于禽类,尤其是水禽。关于水禽(鸭、鹅等)流感,尤