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采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4(human interleu kjn-4,hIL-4)基因。为高效表达hIL-4,促进其临床应用,将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,构建重组载体pBacPAK-hIL-4,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹(1×10~5PFU/头),表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测,用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高,分别达到2.3μg/mL蚕血淋巴和10.2μg/mL体液;SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD;表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。 相似文献
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将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。 相似文献
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用丝心蛋白轻链基因构建转基因家蚕基因打靶载体 总被引:4,自引:0,他引:4
家蚕(Bombyx mori)的丝心蛋白启动子是自然界中最强的启动子之一,若能使外源基因在丝心蛋白启动子控制下得到重要的意义。研究从天蛹中提取家蚕基因组DNA,用PCR的方法克隆了丝心蛋白轻链基因的5kb和0.5kb两个片段。DNA序列分析表明,不同蚕品种2-7外显子范围内DNA序列源性达95.7%。用PCR的方法在GFP基因前端加上凝血酶的识别序列,并克隆到轻链基因的5kb和0.5kb两个片段中间,使GFP基因具有正确的读码框,能和轻链蛋白融合表达。将这一融合的DNA大片段克隆到pBacPAK8转移载体上,构建成一种新型的转基因家蚕打靶载体pBacFL53TG,用于家蚕丝腺生物反应器的研究。 相似文献
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单克隆抗体作为一种具有靶向性的生物大分子,始终是基础医学工作者研究的热点之一。临床上,已被用于治疗肿瘤、病毒感染、自身免疫病、中毒性休克、RH溶血症和抗移植排斥等。但单克隆抗体的临床应用受到一定限制,主要障碍是诱导产生人抗鼠抗体(HAHA反应)、肿瘤渗入量低、亲和力低和半衰期短等。然而,近年来分子生物学技术的发展和向各学科的渗透,人们已经可以通过基因操作技术对抗体进行改造,使其适用于疾病的治疗。如近年来应用噬菌体抗体库技术(phagedisplayantibodylibrarytechniques),筛选具有特异治疗作用的人源性单克隆抗体。另外,通过与基因敲除(knockout)和置换(knockin)技术结合筛选获得完全人源化的单克隆抗体也备受人们的普遍关注。本文就这些技术的基本原理、特点和治疗性抗体的研究进展进行了介绍。 相似文献
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