鰤鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

对鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH对鰤鱼诺卡氏菌生长的影响,并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选,采用正交实验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明,鰤鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为温度25 ℃、盐度5、pH 6.5±0.2;经筛选,鰤鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母粉,促生长作用最强的2种无机盐是磷酸氢二钾（K2HPO4）和氯化钙（CaCl2）;确立了培养基优化配方为葡萄糖20 g·L-1,酵母粉15 g·L-1,K2HPO4 0.75 g·L-1,CaCl 20.2 g·L-1（单独灭菌）,氯化钠（NaCl2）5 g·L-1,pH 6.5±0.2。     

鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

对鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea)ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH对鱼诺卡氏菌生长的影响,并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选,采用正交试验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明,鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为温度25℃、盐度5、pH 6.5±0.2;经筛选,鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母粉,促生长作用最强的2种无机盐是磷酸氢二钾(K2HPO4)和氯化钙(CaCl2);确立了培养基优化配方为葡萄糖20 g·L-1,酵母粉15 g·L-1,K2HPO40.75 g·L-1,CaCl20.2 g·L-1(单独灭菌),氯化钠(NaCl)5 g·L-1,pH 6.5±0.2。     

乌鳢烂身病病原的分离鉴定及病理组织观察

为探究乌鳢Channa argus烂身病的病因及患病乌鳢的体表组织病理学变化,从广东中山某养殖场患烂身病乌鳢病灶处分离到一株优势菌ZS20200317,通过形态学特征、革兰氏染色、16S rRNA及生理生化特性对分离菌株进行鉴定,并检测了该菌株的药物敏感性,最后采用回归感染试验确认分离菌株为导致乌鳢烂身病的病原菌.结果表明:患病乌鳢烂身处的肌肉组织出现了明显变性、坏死和炎症细胞浸润;LB琼脂培养平板培养结果显示,该菌呈边缘光滑有光泽的圆形白色菌落,为革兰氏阴性菌;16S rRNA基因进化分析显示,菌株ZS20200317与维氏气单胞菌Aeromonas veronii的亲缘关系最近,一致性高达98.5％;生理生化试验显示,该菌的赖氨酸脱羧酶、甘露醇、覃糖、蔗糖、氧化酶和VP等生理生化反应为阳性;药敏试验显示,该菌对氯霉素、头孢他啶、头孢氨苄、头孢唑林和头孢拉定沙星等20种抗生素药物敏感,对氨苄西林、苯唑西林、羧苄西林、青霉素G、麦迪霉素、万古霉素和克林霉素7种药物具有耐药性;人工回归感染试验证实,该菌能引起健康乌鳢死亡.研究表明,维氏气单胞菌是广东中山地区乌鳢烂身病的病原,本研究结果为乌鳢维氏气单胞菌病的防控提供了理论依据.     

2株水产病原气单胞菌拮抗菌的筛选鉴定及生物学特性

气单胞菌是水产养殖鱼类的重要病原菌,暂无针对多种气单胞菌感染防治的有效措施。红树林沉积物中芽孢杆菌丰富,是活性微生物的重要储库。笔者自深圳东涌红树林沉积物中筛选获得2株对6种鱼类病原性气单胞菌均具有较强拮抗活性的菌株AH10和AQ1,基于形态学、生理生化特性和分子生物学分析结果,将2株拮抗菌鉴定为解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌。生物学特性测试结果表明,2株菌的生长特性相似,最适生长温度为32℃、pH 5～7、盐度0～20。药敏试验结果显示,2株菌除对四环素耐药、对链霉素中度敏感外,对绝大多数抗生素均高度敏感。拮抗试验结果显示,2株菌除对嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌等6种气单胞菌具有拮抗作用外,亦均对爱德华氏菌、类志贺邻单胞菌等水产病原菌具有拮抗作用。其中,解淀粉芽孢杆菌AH10和贝莱斯芽孢杆菌AQ1分别对类志贺邻单胞菌和杀鲑气单胞菌的拮抗作用最强。生物安全试验表明,2株菌对斑马鱼和鲢均无致病性,生物安全性良好。本研究结果可为水产养殖中气单胞菌病的生物防治提供新的微生物资源,具有较好的应用前景和进一步研究价值。     

一株大鲵虹彩病毒的分离及鉴定

2020年5月,广东广州某野生动物保护基地爆发疑似病毒引发的疾病。现场采样发现,病鲵体长约2 m,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究采用胖头鲤肌肉细胞系(fat head minnow epithelial cells, FHM)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大鲵中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大鲵虹彩病毒广州分离株(CGSIV-GZ)。FHM经患病大鲵组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的FHM细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,FHM细胞中存在大量直径约100～120 nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鲵组织样本进行PCR扩增,获得了431 bp的目的基因片段,测序后经采用BLAST软件分析,发现其与GenBank中的蛙病毒衣壳蛋白基因同源性达96%～99%。确认本次野生动物保护基地大鲵发生大规模死亡是蛙病毒感染所致。     

重组酶介导等温扩增技术检测鰤鱼诺卡氏菌方法的建立

为建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification, RAA)的快速检测鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)的方法,针对鰤鱼诺卡氏菌的特异性基因组片段,设计重组酶介导扩增引物,通过检测7株鰤鱼诺卡氏菌近缘菌和9种水产养殖过程中常见病原菌,筛选出特异性RAA检测引物,并通过将含有目的片段的重组质粒进行梯度稀释以分析该检测方法的灵敏度,最后采用RAA方法检测患病鱼、健康鱼及11种不同来源的鰤鱼诺卡氏菌菌株,以评价该检测方法的应用性和覆盖度。结果表明：本研究中设计的引物仅针对鰤鱼诺卡氏菌可以扩增出目的条带,检测灵敏度为100 pg/μL,人工感染鰤鱼诺卡氏菌的杂交鳢(Channa maculate♀×C.argus♂)肝脏、体肾和脾脏等组织基因组DNA能够扩增出阳性条带,不同来源的鰤鱼诺卡氏菌菌株可以扩增出阳性条带。研究表明,本研究中所建立的鰤鱼诺卡氏菌重组酶介导等温检测方法具有准确、简便的特点,可对鰤鱼诺卡氏菌进行快速检测。